Xác thực các gen tham chiếu cho phân tích biểu hiện định lượng bằng phản ứng chuỗi polymerase thời gian thực (RT-PCR) trong Saccharomyces cerevisiae

Marie-Ange Teste1,2,3,4, Manon Duquenne1,2,3,5,4, Jean François1,2,3,4, Jean-Luc Parrou1,2,3,4
1CNRS, UMR5504, Toulouse, France
2INSA,UPS,INP
3LISBP, Toulouse, France
4Université de Toulouse
5Unité des Bactéries Lactiques et pathogènes Opportunistes, INRA - Centre de Recherche de Jouy-en-Josas, Domaine de Vilvert, Jouy-en Josas, France

Tóm tắt

Tóm tắt Nền tảng

RT-PCR thời gian thực là phương pháp được khuyến nghị cho phân tích biểu hiện gen định lượng. Một bước bắt buộc là chọn các gen tham chiếu tốt để chuẩn hóa. Một vài gen thường được gọi là gen HouseKeeping (HSK), chẳng hạn như ACT1, RDN18 hoặc PDA1, là một trong những gen được sử dụng phổ biến nhất, vì có giả định rằng biểu hiện của chúng không thay đổi nhiều trong một loạt các điều kiện. Vì giả định này rất khó xảy ra, việc trung bình hình học của nhiều gen kiểm soát nội bộ được chọn cẩn thận hiện được khuyến nghị mạnh mẽ cho việc chuẩn hóa nhằm tránh vấn đề biến thiên biểu hiện của các gen tham chiếu đơn lẻ. Mục tiêu của công việc này là tìm kiếm một tập hợp các gen tham chiếu cho phân tích biểu hiện gen chính xác trong Saccharomyces cerevisiae.

Kết quả

Từ các tập dữ liệu vi điều hòa công khai, chúng tôi đã chọn các gen tham chiếu tiềm năng mà biểu hiện của chúng rõ ràng vẫn không thay đổi trong quá trình phát triển lâu dài trên glucose. Sử dụng thuật toán geNorm, ALG9, TAF10, TFC1UBC6 đã cho thấy là những gen có biểu hiện ổn định, không phụ thuộc vào các điều kiện phát triển và nền tảng chủng đã thử nghiệm trong nghiên cứu này. Chúng tôi sau đó đã chỉ ra rằng trung bình hình học của bất kỳ tập hợp nào gồm ba gen trong số sáu gen ổn định nhất cũng cho kết quả dữ liệu chuẩn hóa rất tương đồng, điều này khác biệt với các kết quả không nhất quán giữa các mẫu sinh học khác nhau khi chuẩn hóa được thực hiện với ACT1. Do đó, việc chuẩn hóa với nhiều gen được chọn đã được áp dụng cho phân tích phiên mã của các gen liên quan đến chuyển hóa glycogen. Chúng tôi đã xác định tỷ lệ cảm ứng là 100 lần cho GPH1 và 20 lần cho GSY2 giữa pha số mũ và chuyển tiếp diauxic trên glucose. Không có sự cảm ứng của hai gen này ở pha chuyển tiếp trên galactose, mặc dù trong cả hai trường hợp, động học tích lũy glycogen là tương tự nhau. Ngược lại, biểu hiện của SGA1 không phụ thuộc vào nguồn carbon và tăng gấp 3 lần ở pha dừng lại.

Kết luận

Trong công việc này, chúng tôi đã cung cấp một tập hợp các gen phù hợp làm gen tham chiếu cho phân tích biểu hiện gen định lượng bằng RT-PCR thời gian thực trên các mẫu sinh học men bao gồm một bảng lớn các trạng thái sinh lý. Ngược lại, chúng tôi đã không xác nhận và không khuyến khích việc sử dụng ACT1 cũng như các gen tham chiếu thường sử dụng khác (PDA1, TDH3, RDN18, v.v.) làm các kiểm soát nội bộ cho phân tích biểu hiện gen định lượng trong men.

Từ khóa

#RT-PCR #gene biểu hiện #thực vật #Saccharomyces cerevisiae #chuẩn hóa gen #gen tham chiếu

Tài liệu tham khảo

Bustin SA, Benes V, Nolan T, Pfaffl MW: Quantitative real-time RT-PCR--a perspective. J Mol Endocrinol. 2005, 34 (3): 597-601.

Kubista M, Andrade JM, Bengtsson M, Forootan A, Jonak J, Lind K, Sindelka R, Sjoback R, Sjogreen B, Strombom L, et al: The real-time polymerase chain reaction. Mol Aspects Med. 2006, 27 (2-3): 95-125.

VanGuilder HD, Vrana KE, Freeman WM: Twenty-five years of quantitative PCR for gene expression analysis. Biotechniques. 2008, 44 (5): 619-626.

Wong ML, Medrano JF: Real-time PCR for mRNA quantitation. Biotechniques. 2005, 39 (1): 75-85.

Nolan T, Hands RE, Bustin SA: Quantification of mRNA using real-time RT-PCR. Nat Protoc. 2006, 1 (3): 1559-1582.

Ho-Pun-Cheung A, Cellier D, Lopez-Crapez E: [Considerations for normalisation of RT-qPCR in oncology]. Ann Biol Clin (Paris). 2008, 66 (2): 121-129.

Huggett J, Dheda K, Bustin S, Zumla A: Real-time RT-PCR normalisation; strategies and considerations. Genes Immun. 2005, 6 (4): 279-284.

Liu ZL, Slininger PJ: Universal external RNA controls for microbial gene expression analysis using microarray and qRT-PCR. J Microbiol Methods. 2007, 68 (3): 486-496.

Livak KJ, Schmittgen TD: Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 2001, 25 (4): 402-408.

Cikos S, Bukovska A, Koppel J: Relative quantification of mRNA: comparison of methods currently used for real-time PCR data analysis. BMC Mol Biol. 2007, 8: 113-

Pfaffl MW: Quantification strategies in real-time PCR. A-Z of quantitative PCR. Edited by: Bustin S. 2003, 5: 912-La jolla, CA, USA: International University Line (IUL)

Rebrikov DV, Trofimov D: [Real-time PCR: approaches to data analysis (a review)]. Prikl Biokhim Mikrobiol. 2006, 42 (5): 520-528.

Andersen CL, Jensen JL, Orntoft TF: Normalization of real-time quantitative reverse transcription-PCR data: a model-based variance estimation approach to identify genes suited for normalization, applied to bladder and colon cancer data sets. Cancer Res. 2004, 64 (15): 5245-5250.

Vandesompele J, De Preter K, Pattyn F, Poppe B, Van Roy N, De Paepe A, Speleman F: Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes. Genome Biol. 2002, 3 (7): RESEARCH0034-

Pfaffl MW, Tichopad A, Prgomet C, Neuvians TP: Determination of stable housekeeping genes, differentially regulated target genes and sample integrity: BestKeeper--Excel-based tool using pair-wise correlations. Biotechnol Lett. 2004, 26 (6): 509-515.

Dallas PB, Gottardo NG, Firth MJ, Beesley AH, Hoffmann K, Terry PA, Freitas JR, Boag JM, Cummings AJ, Kees UR: Gene expression levels assessed by oligonucleotide microarray analysis and quantitative real-time RT-PCR -- how well do they correlate?. BMC Genomics. 2005, 6 (1): 59-

Provenzano M, Mocellin S: Complementary techniques: validation of gene expression data by quantitative real time PCR. Adv Exp Med Biol. 2007, 593: 66-73.

Stahlberg A, Elbing K, Andrade-Garda JM, Sjogreen B, Forootan A, Kubista M: Multiway real-time PCR gene expression profiling in yeast Saccharomyces cerevisiae reveals altered transcriptional response of ADH-genes to glucose stimuli. BMC Genomics. 2008, 9: 170-

Vaudano E, Costantini A, Cersosimo M, Del Prete V, Garcia-Moruno E: Application of real-time RT-PCR to study gene expression in active dry yeast (ADY) during the rehydration phase. Int J Food Microbiol. 2009, 129 (1): 30-36.

Nailis H, Coenye T, Van Nieuwerburgh F, Deforce D, Nelis HJ: Development and evaluation of different normalization strategies for gene expression studies in Candida albicans biofilms by real-time PCR. BMC Mol Biol. 2006, 7: 25-

Fang W, Bidochka MJ: Expression of genes involved in germination, conidiogenesis and pathogenesis in Metarhizium anisopliae using quantitative real-time RT-PCR. Mycol Res. 2006, 110 (Pt 10): 1165-1171.

Bohle K, Jungebloud A, Gocke Y, Dalpiaz A, Cordes C, Horn H, Hempel DC: Selection of reference genes for normalisation of specific gene quantification data of Aspergillus niger. J Biotechnol. 2007, 132 (4): 353-358.

Francois J, Parrou JL: Reserve carbohydrates metabolism in the yeast Saccharomyces cerevisiae. FEMS Microbiol Rev. 2001, 25 (1): 125-145.

Parrou JL, Enjalbert B, Plourde L, Bauche A, Gonzalez B, Francois J: Dynamic responses of reserve carbohydrate metabolism under carbon and nitrogen limitations in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 1999, 15 (3): 191-203.

Gancedo C, Flores CL: The importance of a functional trehalose biosynthetic pathway for the life of yeasts and fungi. FEMS Yeast Res. 2004, 4 (4-5): 351-359.

De Risi JL, Iyer VR, Brown PO: Exploring the metabolic and genetic control of gene expression on a genomic scale. Science. 1997, 278 (5338): 680-

Gasch AP, Spellman PT, Kao CM, Carmel-Harel O, Eisen MB, Storz G, Botstein D, Brown PO: Genomic expression programs in the response of yeast cells to environmental changes. Mol Biol Cell. 2000, 11 (12): 4241-4257.

Hwang PK, Tugendreich S, Fletterick RJ: Molecular analysis of GPH1, the gene encoding glycogen phosphorylase in Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biol. 1989, 9 (4): 1659-1666.

Ni HT, LaPorte DC: Response of a yeast glycogen synthase gene to stress. Mol Microbiol. 1995, 16 (6): 1197-1205.

Parrou JL, Enjalbert B, Francois J: STRE- and cAMP-independent transcriptional induction of Saccharomyces cerevisiae GSY2 encoding glycogen synthase during diauxic growth on glucose. Yeast. 1999, 15 (14): 1471-1484.

Rowen DW, Meinke M, LaPorte DC: GLC3 and GHA1 of Saccharomyces cerevisiae are allelic and encode the glycogen branching enzyme. Mol Cell Biol. 1992, 12 (1): 22-29.

Teste MA, Enjalbert B, Parrou JL, Francois JM: The Saccharomyces cerevisiae YPR184w gene encodes the glycogen debranching enzyme. FEMS Microbiol Lett. 2000, 193 (1): 105-110.

Unnikrishnan I, Miller S, Meinke M, LaPorte DC: Multiple positive and negative elements involved in the regulation of expression of GSY1 in Saccharomyces cerevisiae. J Biol Chem. 2003, 278 (29): 26450-26457.

Clancy MJ, Smith LM, Magee PT: Developmental regulation of a sporulation-specific enzyme activity in Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biol. 1982, 2 (2): 171-178.

Ball CA, Jin H, Sherlock G, Weng S, Matese JC, Andrada R, Binkley G, Dolinski K, Dwight SS, Harris MA, et al: Saccharomyces Genome Database provides tools to survey gene expression and functional analysis data. Nucleic Acids Res. 2001, 29 (1): 80-81.

Faccioli P, Ciceri GP, Provero P, Stanca AM, Morcia C, Terzi V: A combined strategy of "in silico" transcriptome analysis and web search engine optimization allows an agile identification of reference genes suitable for normalization in gene expression studies. Plant Mol Biol. 2007, 63 (5): 679-688.

Lee S, Jo M, Lee J, Koh SS, Kim S: Identification of novel universal housekeeping genes by statistical analysis of microarray data. J Biochem Mol Biol. 2007, 40 (2): 226-231.

Wenzel TJ, Teunissen AW, de Steensma HY: PDA1 mRNA: a standard for quantitation of mRNA in Saccharomyces cerevisiae superior to ACT1 mRNA. Nucleic Acids Res. 1995, 23 (5): 883-884.

Choder M: A general topoisomerase I-dependent transcriptional repression in the stationary phase in yeast. Genes Dev. 1991, 5 (12A): 2315-2326.

Choder M, Young RA: A portion of RNA polymerase II molecules has a component essential for stress responses and stress survival. Mol Cell Biol. 1993, 13 (11): 6984-6991.

Monje-Casas F, Michan C, Pueyo C: Absolute transcript levels of thioredoxin- and glutathione-dependent redox systems in Saccharomyces cerevisiae: response to stress and modulation with growth. Biochem J. 2004, 383 (Pt 1): 139-147.

Rosenberg S, Coit D, Tekamp-Olson P: Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase-derived expression cassettes for constitutive synthesis of heterologous proteins. Methods Enzymol. 1990, 185: 341-351.

Kingsman SM, Cousens D, Stanway CA, Chambers A, Wilson M, Kingsman AJ: High-efficiency yeast expression vectors based on the promoter of the phosphoglycerate kinase gene. Methods Enzymol. 1990, 185: 329-341.

Hinnen A, Buxton F, Chaudhuri B, Heim J, Hottiger T, Meyhack B, Pohlig G: Gene expression in recombinant yeast. Bioprocess Technol. 1995, 22: 121-193.

Mumberg D, Muller R, Funk M: Yeast vectors for the controlled expression of heterologous proteins in different genetic backgrounds. Gene. 1995, 156 (1): 119-122.

Nacken V, Achstetter T, Degryse E: Probing the limits of expression levels by varying promoter strength and plasmid copy number in Saccharomyces cerevisiae. Gene. 1996, 175 (1-2): 253-260.

Graham IR, Chambers A: Constitutive expression vectors: PGK. Methods Mol Biol. 1997, 62: 159-169.

Chambers A, Packham EA, Graham IR: Control of glycolytic gene expression in the budding yeast (Saccharomyces cerevisiae). Current Genetics. 1995, 29 (1): 1-

Wang Z, Wilson WA, Fujino MA, Roach PJ: Antagonistic controls of autophagy and glycogen accumulation by Snf1p, the yeast homolog of AMP-activated protein kinase, and the cyclin-dependent kinase Pho85p. Mol Cell Biol. 2001, 21 (17): 5742-5752.

van Dijken JP, Bauer J, Brambilla L, Duboc P, Francois JM, Gancedo C, Giuseppin ML, Heijnen JJ, Hoare M, Lange HC, et al: An interlaboratory comparison of physiological and genetic properties of four Saccharomyces cerevisiae strains. Enzyme Microb Technol. 2000, 26 (9-10): 706-714.

Guillou V, Plourde-Owobi L, Parrou JL, Goma G, Francois J: Role of reserve carbohydrates in the growth dynamics of Saccharomyces cerevisiae. FEMS Yeast Res. 2004, 4 (8): 773-787.

Parrou JL, Francois J: A simplified procedure for a rapid and reliable assay of both glycogen and trehalose in whole yeast cells. Anal Biochem. 1997, 248 (1): 186-188.

Pfaffl MW: A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Res. 2001, 29 (9): e45-