ISME Journal

Giải trình tự DNA tiếp tục giảm chi phí, với Illumina HiSeq2000 có thể tạo ra tới 600 Gb dữ liệu đọc cặp 100 nucleotide trong một chu kỳ mười ngày. Trong nghiên cứu này, chúng tôi trình bày một giao thức cho việc giải trình tự amplicon cộng đồng trên các nền tảng HiSeq2000 và MiSeq của Illumina, và áp dụng giao thức này để giải trình tự 24 cộng đồng vi sinh vật từ các môi trường liên kết với vật chủ và sống tự do. Một câu hỏi quan trọng khi ngày càng có nhiều nền tảng giải trình tự ra đời là liệu các kết luận sinh học dựa trên một nền tảng có nhất quán với những gì sẽ nhận được từ một nền tảng khác hay không. Chúng tôi đã chỉ ra rằng giao thức phát triển cho các thiết bị này đã lấy lại thành công các kết quả sinh học đã biết, và thêm vào đó, các kết luận sinh học là nhất quán giữa các nền tảng giải trình tự (HiSeq2000 so với MiSeq) và giữa các vùng được giải trình tự của các amplicon.

Các hệ thống phân loại tham chiếu là rất quan trọng để cung cấp một khung phân loại cho việc giải thích các khảo sát gene đánh dấu và metagenomic, vốn đang tiếp tục phát hiện ra các loài mới với tốc độ đáng kể. Greengenes là một cơ sở dữ liệu gene 16S rRNA toàn bộ chuyên dụng, cung cấp cho người dùng một hệ thống phân loại được chỉnh sửa dựa trên việc suy diễn cây kiểu de novo. Chúng tôi đã phát triển một phương pháp 'phân loại thành cây' để chuyển giao các tên nhóm từ một hệ thống phân loại hiện có sang một hình thái cây, và đã sử dụng nó để áp dụng các hệ thống phân loại Greengenes, Trung tâm Thông tin Công nghệ Sinh học Quốc gia (NCBI) và cyanoDB (chỉ dành cho vi khuẩn lam) vào một cây de novo bao gồm 408.315 chuỗi. Chúng tôi cũng đã bao gồm thông tin cấp bậc rõ ràng do hệ thống phân loại NCBI cung cấp cho các tên nhóm (bằng cách tiền tố các chỉ định cấp bậc) nhằm cải thiện định hướng người dùng và tính nhất quán trong phân loại. Hệ thống phân loại hợp nhất mà chúng tôi tạo ra đã cải thiện phân loại của 75% các chuỗi theo một hoặc nhiều cấp bậc so với hệ thống phân loại NCBI gốc, với những cải tiến rõ ràng nhất xảy ra ở các chuỗi môi trường bị phân loại thấp. Chúng tôi cũng đã đánh giá các bộ phận (nhóm) ứng cử viên hiện được xác định bởi NCBI và trình bày các khuyến nghị để hợp nhất 34 nhóm có tên gọi trùng lặp. Tất cả các kết quả trung gian từ quy trình, bao gồm suy diễn cây, jackknifing và chuyển giao một hệ thống phân loại cho một cây nhận (tax2tree) đều có sẵn để tải xuống. Hệ thống phân loại Greengenes được cải thiện này nên cung cấp cơ sở hạ tầng quan trọng cho nhiều dự án megasequencing nghiên cứu các hệ sinh thái trên các quy mô từ cơ thể của chúng ta (Dự án Vi sinh vật Người) đến toàn bộ hành tinh (Dự án Vi sinh vật Địa cầu). Việc triển khai phần mềm có thể được lấy từ http://sourceforge.net/projects/tax2tree/.

Đất được thu thập qua một thí nghiệm đã bón vôi lâu dài (pH 4.0–8.3), trong đó sự biến đổi của các yếu tố khác ngoài pH đã được giảm thiểu, được sử dụng để khảo sát ảnh hưởng trực tiếp của pH lên sự phong phú và thành phần của hai nhóm chính trong vi sinh vật đất: nấm và vi khuẩn. Chúng tôi giả thuyết rằng các cộng đồng vi khuẩn sẽ bị ảnh hưởng mạnh bởi pH hơn là các cộng đồng nấm. Để xác định tỷ lệ phong phú tương đối của vi khuẩn và nấm, chúng tôi đã sử dụng PCR định lượng (qPCR), và để phân tích thành phần và đa dạng của các cộng đồng vi khuẩn và nấm, chúng tôi đã sử dụng kỹ thuật tuần tự song song có mã vạch. Cả tỷ lệ phong phú tương đối và đa dạng của vi khuẩn đều có quan hệ dương với pH, trong đó tỷ lệ phong phú gần như tăng gấp đôi giữa pH 4 và 8. Trái lại, tỷ lệ phong phú tương đối của nấm không bị ảnh hưởng bởi pH và độ đa dạng của nấm chỉ có liên hệ yếu với pH. Thành phần của các cộng đồng vi khuẩn được xác định chặt chẽ bởi pH của đất; có sự biến đổi thành phần cộng đồng vi khuẩn dọc theo khoảng cách 180 mét của thí nghiệm này cũng như so với đất thu thập từ nhiều biôma khác nhau ở Bắc và Nam Mỹ, nhấn mạnh sự chi phối của pH trong việc cấu trúc các cộng đồng vi khuẩn. Ảnh hưởng trực tiếp rõ ràng của pH lên thành phần của cộng đồng vi khuẩn có lẽ do phạm vi pH hẹp cho sự phát triển tối ưu của vi khuẩn. Thành phần cộng đồng nấm ít bị ảnh hưởng bởi pH hơn, điều này phù hợp với các nghiên cứu văn hóa thuần túy, cho thấy nấm thường có các phạm vi pH rộng hơn cho sự phát triển tối ưu.

Những tiến bộ gần đây đã cho phép phân tích dữ liệu giải trình tự gene đánh dấu có độ thông lượng cao mà không cần phải xây dựng các đơn vị phân loại hoạt động phân tử (OTU) như thông thường: các cụm các đọc giải trình tự khác biệt dưới một ngưỡng khác biệt cố định. Các phương pháp mới kiểm soát lỗi đủ mức để các biến thể trình tự amplicon (ASV) có thể được phân giải chính xác, xuống đến cấp độ khác biệt một nucleotide trong vùng gene được giải trình tự. Những lợi ích của việc có độ phân giải tinh vi hơn trở nên rõ ràng ngay lập tức, và các lập luận cho các phương pháp ASV đã tập trung vào độ phân giải cải thiện của chúng. Ít rõ ràng hơn, nhưng chúng tôi tin rằng quan trọng hơn, là những lợi ích rộng lớn phát sinh từ tình trạng của ASV như là những nhãn nhất quán với ý nghĩa sinh học nội tại được xác định độc lập với cơ sở dữ liệu tài liệu tham khảo. Tại đây, chúng tôi thảo luận cách mà những đặc điểm này mang lại cho ASV những lợi thế kết hợp của OTU tham chiếu khép kín —bao gồm chi phí tính toán tỷ lệ với quy mô nghiên cứu, sự ghép đơn giản giữa các tập dữ liệu được xử lý độc lập, và dự đoán tiến về phía trước—và của OTU de novo —bao gồm đo lường độ đa dạng chính xác và khả năng áp dụng cho các cộng đồng thiếu phủ sóng sâu trong các cơ sở dữ liệu tài liệu tham khảo. Chúng tôi lập luận rằng những cải tiến về độ tái sử dụng, độ tái lập và tính toàn diện là đủ lớn để ASV nên thay thế OTU như là đơn vị tiêu chuẩn trong phân tích và báo cáo dữ liệu gene đánh dấu.

Độ mặn là yếu tố chính điều khiển sự phân bố của sinh vật trong hệ thống thủy sinh, và hầu hết các sinh vật đa bào thủy sinh đều thích ứng với cuộc sống trong điều kiện nước mặn hoặc nước ngọt. Do đó, các khu vực pha trộn nước mặn và nước ngọt ở các vùng ven biển hoặc cửa sông có sự đa dạng về động thực vật hạn chế. Mặc dù sự thay đổi về đa dạng và sự suy giảm số lượng loài trong nước lợ đã được tài liệu hóa rõ ràng trong sinh thái học thủy sinh, nhưng mức độ áp dụng của điều này đối với các cộng đồng vi khuẩn vẫn chưa được biết đến. Ở đây, chúng tôi báo cáo một kho dữ liệu vi khuẩn chi tiết đầu tiên từ các mẫu dọc theo 60 trạm lấy mẫu phân bố dọc theo gradient độ mặn của Biển Baltic, một trong những môi trường nước lợ lớn nhất thế giới, được tạo ra thông qua kỹ thuật giải trình tự 454 pyrosequencing các gene 16S rRNA phần (400 bp). Trong gradient độ mặn, thành phần cộng đồng vi khuẩn đã thay đổi ở các cấp độ phát sinh chủng loại rộng và chi tiết hơn. Tương tự như các cộng đồng động vật trong điều kiện nước lợ, chúng tôi đã xác định được một cộng đồng vi khuẩn nước lợ bao gồm sự kết hợp đa dạng của các nhóm nước ngọt và nước biển, cùng với các quần thể độc nhất cho môi trường này. Khi thời gian cư trú của nước ở Biển Baltic vượt quá 3 năm, cộng đồng vi khuẩn quan sát được không thể là kết quả của sự pha trộn giữa nước ngọt và nước mặn, mà nghiên cứu của chúng tôi đại diện cho mô tả chi tiết đầu tiên về một hệ vi sinh vật nước lợ bản địa. Ngược lại với sự suy giảm đa dạng của các sinh vật đa bào, sự giảm đa dạng vi khuẩn trong điều kiện nước lợ không thể được xác lập. Có thể rằng tốc độ thích ứng nhanh của vi khuẩn đã cho phép một loạt các dòng dõi lấp đầy một trong những sinh cảnh sinh thái đầy thử thách và tương đối ít người chiếm đóng của các sinh vật cao hơn.

Khám phá các tập dữ liệu môi trường lớn được tạo ra bởi các công nghệ giải trình tự DNA nhanh đòi hỏi những phương pháp phân tích mới để vượt ra ngoài các mô tả cơ bản về thành phần và đa dạng của các cộng đồng vi sinh vật tự nhiên. Để điều tra các tương tác tiềm năng giữa các taxa vi sinh vật, phân tích mạng của các mẫu đồng tồn tại của taxa có ý nghĩa có thể giúp làm sáng tỏ cấu trúc của các cộng đồng vi sinh vật phức tạp qua các gradient không gian hoặc thời gian. Ở đây, chúng tôi đã tính toán các mối liên kết giữa các taxa vi sinh vật và áp dụng các phương pháp phân tích mạng cho một tập dữ liệu giải trình tự pyrosequencing theo mã vạch gene 16S rRNA chứa hơn 160,000 chuỗi vi khuẩn và archae từ 151 mẫu đất thuộc một loạt các loại hệ sinh thái. Chúng tôi đã mô tả hình thái của mạng lưới kết quả và định nghĩa các loại đơn vị phân loại hoạt động dựa trên sự phong phú và sự chiếm đóng (tức là, những chuyên gia chung về môi trường và những chuyên gia đặc thù về môi trường). Các mẫu đồng tồn tại đã được tiết lộ dễ dàng, bao gồm sự liên kết không ngẫu nhiên tổng quát, các chiến lược lịch sử sống phổ biến ở các cấp thuế học rộng và các mối quan hệ bất ngờ giữa các thành viên của cộng đồng. Tổng thể, chúng tôi đã chứng minh tiềm năng của việc khám phá các tương quan giữa các taxa để có được một hiểu biết toàn diện hơn về cấu trúc của cộng đồng vi sinh vật và các quy tắc sinh thái hướng dẫn sự hình thành cộng đồng.

Sự thay đổi không gian trong thành phần của các cộng đồng sinh học được điều khiển bởi (sinh thái học) Trôi dạt, Lựa chọn và Phân tán. Các công cụ thống kê được áp dụng phổ biến không thể ước lượng định lượng các quá trình này, cũng như không xác định được các yếu tố vô sinh áp đặt lên các quá trình này. Để kiểm tra các cộng đồng vi sinh vật dưới mặt đất phân bố ở hai cấu trúc địa chất khác nhau của tầng nước ngầm không kín dưới địa điểm Hanford ở phía đông nam bang Washington, chúng tôi đã phát triển một khung phân tích nhằm nâng cao hiểu biết sinh thái theo hai cách chính. Đầu tiên, chúng tôi định lượng ước lượng ảnh hưởng của Trôi dạt, Lựa chọn và Phân tán. Thứ hai, các mô hình sinh thái được sử dụng để xác định các biến vô sinh đã đo đạc và chưa đo đạc áp đặt Lựa chọn hoặc dẫn đến mức độ Phân tán thấp. Chúng tôi nhận thấy rằng (i) Trôi dạt một mình liên tục chiếm khoảng 25% sự thay đổi không gian trong thành phần cộng đồng; (ii) ở trầm tích sâu hơn, có kích thước hạt mịn hơn, Lựa chọn là mạnh (chiếm khoảng 60% sự thay đổi), được áp đặt bởi một biến môi trường chưa được đo lường nhưng có cấu trúc không gian; (iii) ở trầm tích nông hơn, có kích thước hạt thô hơn, Lựa chọn yếu hơn (chiếm khoảng 30% sự thay đổi), được áp đặt bởi các yếu tố thủy văn có cấu trúc theo chiều dọc và chiều ngang; (iv) mức độ Phân tán thấp có thể chiếm gần 30% sự thay đổi và chủ yếu do sự cô lập không gian gây ra bởi việc trao đổi hạn chế giữa các trầm tích hạt mịn và hạt thô; và (v) các trầm tích rất thấm có liên quan đến mức độ Phân tán cao dẫn đến sự đồng nhất trong thành phần cộng đồng và chiếm hơn 20% sự thay đổi. Chúng tôi cũng cho thấy rằng khung phân tích của chúng tôi cung cấp những suy luận không thể đạt được bằng các phương pháp đã có, và gợi ý rằng việc áp dụng rộng rãi sẽ giúp thúc đẩy sự hiểu biết thống nhất về các cộng đồng vi sinh vật.

Mục tiêu chính của sinh thái học cộng đồng vi sinh vật là hiểu các lực lượng cấu thành nên thành phần cộng đồng. Lựa chọn xác định bởi các yếu tố môi trường cụ thể đôi khi quan trọng, nhưng trong những trường hợp khác, các quy trình ngẫu nhiên hoặc trung tính sinh thái chiếm ưu thế. Thiếu một khuôn khổ khái niệm thống nhất nhằm hiểu tại sao các quy trình xác định chiếm ưu thế trong một số bối cảnh nhưng không phải trong những bối cảnh khác. Ở đây, chúng tôi làm việc hướng tới một khuôn khổ như vậy. Bằng cách thử nghiệm các dự đoán được đưa ra từ lý thuyết sinh thái tổng quát, chúng tôi nhằm khám phá các yếu tố điều khiển ảnh hưởng tương đối của các quy trình xác định và ngẫu nhiên. Chúng tôi kết hợp dữ liệu không gian-thời gian về các cộng đồng vi sinh vật dưới bề mặt và các tham số môi trường với các chỉ số và mô hình giả định về thành phần phát sinh loài trong và giữa các cộng đồng. Thử nghiệm tín hiệu phát sinh loài trong các ngách sinh vật cho thấy các taxa có họ hàng gần gũi hơn có các liên kết với môi trường sống tương tự hơn. Phân tích phát sinh loài cộng đồng cho thấy các taxa sinh thái tương tự cùng tồn tại nhiều hơn mức dự kiến do ngẫu nhiên. Lọc môi trường do đó điều khiển một cách xác định thành phần cộng đồng vi sinh vật dưới bề mặt. Quan trọng hơn, sự ảnh hưởng của lọc môi trường xác định tương đối với các yếu tố ngẫu nhiên đạt tối đa ở cả hai đầu của một gradient biến thiên môi trường. Tuy nhiên, vai trò mạnh mẽ của các yếu tố ngẫu nhiên được hỗ trợ qua các phân tích lật đổ phát sinh loài theo thời gian. Mặc dù mức độ lật đổ phát sinh loài trung bình nhanh hơn mức dự kiến, hầu hết các so sánh cặp đều không có sự ngẫu nhiên đáng kể. Sự ảnh hưởng tương đối của lọc môi trường xác định đối với động lực cộng đồng đã tăng lên; tuy nhiên, trong các môi trường có biến thiên về thời gian và không gian cao nhất. Kết quả của chúng tôi chỉ ra các quy tắc chung điều khiển ảnh hưởng tương đối của các quy trình ngẫu nhiên và xác định trên các sinh vật vi mô và vĩ mô.

Có sự hiểu biết chung về khả năng của các chất tiết từ rễ ảnh hưởng đến cấu trúc của cộng đồng vi sinh vật trong rễ. Tuy nhiên, kiến thức của chúng ta về mối liên hệ giữa sự phát triển của cây, sự tiết rễ và sự tập hợp vi sinh vật còn hạn chế. Ở đây, chúng tôi đã phân tích cấu trúc của cộng đồng vi khuẩn trong rễ liên quan đến Arabidopsis tại bốn thời điểm khác nhau tương ứng với các giai đoạn phát triển khác nhau của cây: cây con, sinh trưởng, ra hoa và ra trái. Tổng thể, không có sự khác biệt đáng kể trong cấu trúc cộng đồng vi khuẩn, nhưng chúng tôi quan sát thấy rằng cộng đồng vi sinh vật ở giai đoạn cây con khác biệt so với các thời điểm phát triển khác. Ở cấp độ chi tiết hơn, các ngành như Acidobacteria, Actinobacteria, Bacteroidetes, Cyanobacteria và một số chi riêng biệt trong các ngành đó theo dõi các mô hình khác nhau liên quan đến sự phát triển của cây và sự tiết rễ. Những kết quả này gợi ý rằng cây có thể chọn một tập hợp con vi sinh vật ở các giai đoạn phát triển khác nhau, có lẽ cho các chức năng cụ thể. Tương ứng, phân tích metatranscriptomics của vi sinh vật trong rễ tiết lộ rằng có 81 bản sao duy nhất được biểu hiện khác biệt (P<0.05) tại các giai đoạn phát triển khác nhau của cây. Chẳng hạn, các gen liên quan đến tổng hợp streptomycin được kích thích đáng kể ở các giai đoạn ra hoa và ra trái, có thể nhằm mục đích kiểm soát bệnh tật. Chúng tôi suy đoán rằng cây tiết ra hỗn hợp các hợp chất và các hóa chất thực vật cụ thể trong các chất tiết từ rễ mà được sản xuất một cách khác nhau ở các giai đoạn phát triển khác nhau nhằm giúp tổ chức sự tập hợp của vi sinh vật trong rễ.