European Journal of Immunology

Các mức interleukin 6 (IL 6/Faktor kích thích tế bào B-2) cao đã được phát hiện trong dịch khớp từ các khớp của bệnh nhân viêm khớp dạng thấp (RA) đang hoạt động. Các tế bào được tìm thấy trong dịch khớp tươi vừa mới phân lập biểu hiện IL6 mRNA một cách liên tục. Các mô synovial thu được qua sinh thiết khớp cũng đã được phát hiện sản xuất IL6 in vitro. Phân tích miễn dịch hóa mô cho thấy các tế bào T CD2⁺ cũng như các tế bào B blastoid CD20⁺ trong các mô khớp sản xuất IL6. Dữ liệu cho thấy rằng IL6 được sinh ra một cách liên tục trong RA và sự sản xuất quá mức của nó có thể giải thích cho các triệu chứng cục bộ cũng như tổng quát của RA, vì IL6 có thể hoạt động như một yếu tố tăng trưởng và biệt hóa tế bào B cũng như yếu tố kích thích tế bào gan.

Việc cách ly và phát triển các dòng T lymphoblast đặc hiệu kháng nguyên có chức năng được mô tả. Những dòng tế bào này được phát hiện có khả năng nhận diện các kháng nguyên ngoại lai hoặc tự thân liên quan đến các tế bào hỗ trợ của kiểu gen phức hợp di truyền chính tương đồng. Việc tiêm tĩnh mạch một tế bào T chỉ phản ứng với protein cơ bản myelin đã dẫn đến sự phát triển tình trạng liệt lâm sàng ở chuột đồng gene tương đồng. Do đó, có thể nghiên cứu chức năng sinh học cũng như đặc hiệu kháng nguyên bằng cách sử dụng các dòng tế bào T.

Đặc hiệu kháng thể được xác định bởi các gen v cấu trúc mã hóa cho các chuỗi axit amin của các vùng biến đổi của chuỗi polypeptid kháng thể. Giả thuyết hiện tại đề xuất rằng các tế bào sinh dục của một động vật mang một tập hợp các gen v xác định các vị trí kết hợp của các kháng thể hướng về một tập hợp hoàn chỉnh của một lớp kháng nguyên tương thích mô nhất định mà loài động vật này thuộc về. Sự phát triển tiến hóa của tập hợp gen v này trong hệ sinh thái được truy tìm về yêu cầu cho việc nhận diện tế bào đến tế bào trong tất cả các dạng sống đa bào. Giả thuyết dẫn đến sự phân biệt giữa hai quần thể tế bào nhạy cảm với kháng nguyên. Một quần thể bao gồm các tế bào tạo thành kháng thể chống lại các kháng nguyên lạ; các lympho bào này đã xuất hiện như là các đột biến trong các dòng con của các tế bào gốc lympho biểu hiện các gen v thuộc tập con (tập con S) mã hóa cho kháng thể chống lại các kháng nguyên tương thích mô mà cá thể đó sở hữu. Quần thể còn lại bao gồm các lympho bào từ chối ghép tự do mà biểu hiện các gen v của tập con còn lại (tập con A) mã hóa cho kháng thể chống lại các kháng nguyên tương thích mô của loài mà cá thể đó không sở hữu. Các cơ quan lympho chính được coi là các cơ quan sinh đột biến. Trong các cơ quan này (ví dụ trong tuyến ức), sự phát triển của các lympho bào biểu hiện các gen v của tập con S và sự ức chế tiếp theo của các tế bào trong các dòng “cấm” này dẫn đến việc lựa chọn các tế bào đột biến biểu hiện các gen v đã được sửa đổi thông qua đột biến soma ngẫu nhiên. Quá trình này tạo ra sự tự dung nạp cũng như một quần thể đa dạng các tế bào nhạy cảm với kháng nguyên phản ánh sự đa dạng về kháng thể. Sự phát triển trong các cơ quan lympho chính của các lympho bào biểu hiện các gen v của tập con A tạo ra quần thể tế bào nhạy cảm với kháng nguyên mà chịu trách nhiệm cho sự tấn công allo.

Thuyết này giải thích cách mà một hệ thống miễn dịch chức năng có thể phát triển thông qua áp lực lựa chọn do các kháng nguyên tự thân gây ra, bắt đầu trong một giai đoạn sớm trong phát triển mà diễn ra trước khi việc lựa chọn lâm sàng bởi các kháng nguyên lạ. Giả thuyết cung cấp các giải thích cho sự đa dạng của các vùng đầu N của các chuỗi polypeptid kháng thể, cho sự kiểm soát di truyền chiếm ưu thế của phản ứng miễn dịch đặc hiệu bởi các alen tương thích mô, cho sự ưu thế tương đối của các tế bào nhạy cảm với kháng nguyên hướng tới các kháng nguyên tương thích mô allo, cho các idiotype kháng thể, cho sự loại trừ alen, cho sự cam kết trước của bất kỳ lympho bào nhạy cảm với kháng nguyên nào để tạo ra kháng thể của chỉ một loại phân tử và cho động lực tế bào trong các mô lympho chính.

Các dòng tế bào chuột thuộc các dòng di truyền khác nhau đã được thiết lập, có khả năng tiết ra liên tục một lượng lớn interleukin chuột tái tổ hợp (mIL2, mIL3, mIL4 hoặc mIL5). Một vector biểu hiện dựa trên virus papilloma bò hiện có, pBV-lMTHA, đã được sửa đổi để cho phép các tế bào myeloma X63Ag8-653, tế bào fibroblast NIH 3T3 và tế bào khối u vú C127 mang ổn định nhiều bản sao của vector, biểu hiện cDNA được chèn mã hóa một interleukin duy nhất một cách liên tục, và tiết ra interleukin với số lượng lớn.

Các dòng tế bào biến đổi với cDNA mIL2 mang ổn định từ 30 đến 100 bản sao của plasmid mỗi tế bào và tiết ra mIL2 sinh học hoạt động một cách liên tục với số lượng tương tự như được sản xuất bởi các tế bào thymo EL4 chuột hoặc các tế bào lách chuột đã được kích thích bằng mitogen. Việc xóa bỏ vùng không dịch mã 3′ chứa các chuỗi giàu AT khỏi cDNA mIL2 đã dẫn đến việc tăng gấp 100 lần trong khả năng sản xuất và tiết ra mIL2 bởi các biến thể. Sự bổ sung của kim loại nặng đã tăng cường sản xuất từ 2 đến 6 lần. Các tế bào biến đổi với cDNA mIL3 đã bị xóa 3′ tiết ra hoạt tính mIL3 cao hơn từ 300 đến 1000 lần so với dòng bạch cầu đơn nhân myelomonocytic WEHI 3. mIL 4 do các biến thể tương tự sản xuất đã kích thích khả năng hấp thu [³H]thymidine của dòng tế bào T, dòng tế bào mast và các tế bào bạch cầu B, đồng thời tăng cường sản xuất IgG₁ bởi các tế bào B. Nồng độ IL 4 cao hơn 150 lần so với nồng độ được sản xuất bởi dòng tế bào T 2.19 được kích thích bằng concanavalin A. mIL 5 đã được tiết ra bởi các biến thể tương tự ở titer cao hơn 10 lần so với các tế bào T 2.19 được kích thích bằng concanavalin A, được đánh giá thông qua sự phát triển và trưởng thành của bạch cầu B BCL1. Các vector biểu hiện này được cho là hữu ích trong việc thiết lập các dòng tế bào eukaryote sản xuất protein từ các bản sao cDNA hoàn chỉnh với tỷ lệ cao hơn. Các dòng tế bào đã được thiết lập có khả năng tiết ra IL2, 3, 4 hoặc 5 với tỷ lệ cao nên là nguồn cung cấp hữu ích cho các interleukin này trong việc nghiên cứu chức năng của chúng trong hệ miễn dịch.

Bạch cầu đơn nhân của con người sản xuất một yếu tố tăng trưởng (HGF) cho các tế bào hybridoma và plasmacytoma. Gần đây, HGF đã được chứng minh là giống với IFN-β2, protein 26 kDa và BSF-2. HGF có thể được định lượng trong một thử nghiệm sự tăng trưởng với dòng tế bào hybridoma phụ thuộc HGF B13.29. Bằng cách chọn lọc một biến thể cực kỳ nhạy cảm của dòng tế bào này, chúng tôi có thể đo lường sự sản xuất HGF của các tế bào đơn lẻ. Phân tích pha loãng hạn chế của các tế bào sản xuất kết hợp với kích thước, mật độ và đặc điểm bám dính cho thấy HGF được sản xuất bởi các tế bào đơn nhân và không phải bởi các tế bào lympho. Không cần kích thích cho các tế bào đơn nhân nhưng các tế bào lại cần presence của huyết thanh. Yêu cầu huyết thanh này có thể được đáp ứng bởi albumin huyết thanh bò tinh khiết, nhưng không phải bởi các protein khác như ovalbumin hay γ-globulin của người. Sự sản xuất HGF in vitro của các tế bào đơn nhân bắt đầu sau 2 giờ nuôi cấy và hoàn tất trong vòng 24 giờ.

IL‐6 là một cytokine đa tác dụng tham gia vào sinh lý của hầu hết các hệ thống cơ quan. Các nghiên cứu gần đây đã chứng minh rằng IL‐6 có vai trò rất quan trọng trong việc điều chỉnh sự cân bằng giữa các tế bào Th17 sản xuất IL‐17 và các tế bào T điều hòa (Treg). Hai nhóm tế bào T này đóng vai trò nổi bật trong các chức năng miễn dịch: tế bào Th17 là một yếu tố chủ chốt trong bệnh sinh của các bệnh tự miễn và bảo vệ chống lại các nhiễm khuẩn do vi khuẩn, trong khi Treg có chức năng kiềm chế các phản ứng của tế bào T hiệu ứng quá mức. IL‐6 kích thích sự phát triển của các tế bào Th17 từ các tế bào T chưa trưởng thành cùng với TGF‐β; ngược lại, IL‐6 ức chế sự phân hóa Treg do TGF‐β gây ra. Sự mất cân bằng hoặc sản xuất quá mức IL‐6 dẫn đến các bệnh tự miễn như xơ cứng đa diễn (MS) và viêm khớp dạng thấp (RA), trong đó các tế bào Th17 được coi là nguyên nhân chính của bệnh sinh. Với vai trò quan trọng của IL‐6 trong việc thay đổi sự cân bằng giữa tế bào Treg và Th17, việc kiểm soát hoạt động của IL‐6 tiềm năng là một cách tiếp cận hiệu quả trong điều trị các bệnh tự miễn và viêm nhiễm khác nhau. Ở đây, chúng tôi xem xét vai trò của IL‐6 trong việc điều chỉnh cân bằng Th17/Treg và mô tả các chức năng quan trọng của IL‐6 và Th17 trong miễn dịch và bệnh lý miễn dịch.

Một dòng tế bào hybridoma tiết ra một kháng thể đơn dòng đặc hiệu cho tế bào thực bào (MΦ), được gọi là F4/80, đã được tạo ra bằng cách gộp các tế bào lách từ một con chuột đã được tiêm chủng quá mức với tế bào MΦ của chuột được nuôi cấy bằng thioglycollate và kết hợp với một dòng tế bào u bạch cầu chuột, NS1. Sự kết hợp của kháng thể với các tế bào chính và dòng tế bào đã được phát hiện bằng phương pháp phân tích liên kết gián tiếp bằng miễn dịch phóng xạ, hình ảnh tự động hoặc phân tích dòng tế bào kích hoạt bằng huỳnh quang. F4/80 liên kết với tế bào MΦ của chuột từ khoang bụng hoặc các nguồn khác, tế bào đơn nhân trong máu, MΦ phát triển từ các tiền thân tủy xương trong nuôi cấy và các dòng tế bào tương tự MΦ, nhưng không liên kết với các tế bào khác, bao gồm bạch cầu đa nhân và lympho. F4/80 không liên kết với MΦ thông qua các thụ thể Fc, không có tính độc tế bào và thuộc nhóm IgG_2b của chuột. Do F4/80 liên kết với tất cả các MΦ được xác định bởi độ bám dính, hình thái và khả năng thực bào miễn dịch, nó cung cấp một dấu hiệu mới để xác định MΦ ở chuột. Có sự khác biệt lớn trong việc biểu hiện kháng nguyên F4/80, phụ thuộc vào sự kích thích nội bụng, thời gian nuôi cấy và giai đoạn trưởng thành. Các thí nghiệm kết tủa miễn dịch đã chứng minh rằng kháng nguyên F4/80 là một phần của một thành phần có khối lượng phân tử 160000 được tổng hợp bởi MΦ và, ít nhất một phần, được phơi bày trên bề mặt tế bào.

Các kỹ thuật hợp nhất tế bào đã được sử dụng để tạo ra các dòng tế bào lai giữa tế bào u tủy và tế bào sản xuất kháng thể. Các dòng lai thu được đã thích nghi vĩnh viễn để phát triển trong nuôi cấy mô và có khả năng gây ra các khối u sản xuất kháng thể ở chuột.

Lách từ chuột được miễn dịch với tế bào máu đỏ cừu (SRBC) đã được hợp nhất với một dòng tế bào 8-azaguanine kháng (X63-Ag8) của u tủy MOPC 21. Hơn 50% các dòng lai thu được sản xuất và tiết ra các immunoglobulin khác với u tủy MOPC 21. Khoảng 10% các dòng lai thể hiện hoạt tính chống SRBC. Tỷ lệ cao của các tế bào lai sản xuất kháng thể cho thấy rằng quá trình hợp nhất liên quan đến một phần giới hạn của quần thể tế bào lách, có khả năng là các tế bào đã cam kết sản xuất kháng thể.

Để tránh sự hiện diện của chuỗi nặng MOPC 21 trong các dòng lai đặc hiệu, một dòng tế bào u tủy khác (NSI/1-Ag4–1) đã được sử dụng. Đây là một biến thể không tiết của u tủy MOPC 21 mà không biểu hiện các chuỗi nặng.

Ba dòng lai sản xuất kháng thể chống SRBC (có thể thuộc các lớp μ, γ_2b và γ₁, tương ứng) và hai dòng lai sản xuất kháng thể chống 2,4,6-trinitrophenyl (thuộc lớp μ) đã được nhân giống nhiều lần. Thông qua việc lựa chọn ngẫu nhiên và lựa chọn các dòng đặc hiệu dựa trên hoạt tính ly giải của chúng (lựa chọn mảng dòng), một số dòng khác nhau đã được xây dựng. Các dòng này thể hiện các sự kết hợp khác nhau của bốn chuỗi có thể có của mỗi dòng lai: các chuỗi γ và k từ u tủy và các chuỗi kháng thể nặng và nhẹ đặc hiệu. Trong ba trường hợp (Sp1, Sp2 và Sp7) cho thấy rằng chỉ có sự kết hợp chuỗi nặng và nhẹ đặc hiệu có hoạt tính và rằng các chuỗi từ u tủy không thể thay thế cho chúng. Trong hầu hết các trường hợp, các dòng đã được thu được không còn biểu hiện các chuỗi MOPC 21 nữa mà chỉ biểu hiện các chuỗi kháng thể đặc hiệu.

Một phương pháp nhanh chóng được mô tả để loại bỏ hiệu quả các tế bào mang immunoglobulin từ các huyết thanh lách hoặc hạch bạch huyết của chuột đã được kích hoạt hoặc chưa được kích hoạt. Việc ủ các huyết thanh tế bào trong các cột len nylon trong 45 phút tại 37 °C dẫn đến việc giảm từ 9 đến 100 lần số lượng tế bào mang immunoglobulin và làm giàu bổ sung từ 1,5 đến 2 lần tế bào T trong các quần thể chất thải của cột.

Dân số chất thải, xuất phát từ việc đi qua các tế bào lách qua những cột này, gần như không có hoạt động của tiền thân tế bào B và tế bào ghi nhớ, nhưng chứa toàn bộ hoạt động tiền thân của tế bào trợ giúp và tế bào hiệu ứng sát thủ khi so sánh với các tế bào lách chưa được phân tách.

The B cell antigen receptor is a complex containing the antigen‐binding immunoglobulin molecules and the Ig‐α/Ig‐β heterodimer which presumably connects the B cell antigen receptor to intracellular signaling components. To analyze the functional properties of the cytoplasmic parts of the B cell antigen receptor, we used the K46 B lymphoma line (IgG2a, χ) to express chimeric molecules composed of the extracellular and transmembrane part of the CD8α molecule and the cytoplasmic sequence of either the Ig‐α (CD8α/Ig‐α), the Ig‐β (CD8α/Ig‐β) protein or the membrane‐bound γ2a heavy chain (CD8α/γ2a). From these three types of chimeric molecules only CD8α/Ig‐α and CD8α/Ig‐β, but not CD8α/γ2a, could transduce signals, thus providing the first evidence that the cytoplasmic tail of Ig‐α and Ig‐β have a signaling capacity. After cross‐linking with anti‐CD8α antibodies, both molecules induced a similar increase in intracellular free calcium ion and in MAP kinase phosphorylation. Protein tyrosine kinases, however, were strongly activated via the CD8α/Ig‐α and only marginally via the CD8α/Ig‐β molecule. This suggests that the Ig‐α and Ig‐β proteins have distinct roles during signal transduction through the B cell antigen receptor.