Biochemistry and Cell Biology

Việc đưa vào [methyl-¹⁴C]CDP-choline vào phosphatidylcholine đã được đo trong các tế bào HeLa đã được làm thấm bằng 0,125 mg digitonin/mL. Tốc độ hình thành phosphatidylcholine bị ảnh hưởng bởi nồng độ CDP-choline trong môi trường. Enzyme CDP-choline: 1,2-diacylglycerol cholinephosphotransferase trong các tế bào thấm cho thấy K_m là 88 μM đối với CDP-choline. Một giá trị K_m tương tự là 104 μM được tìm thấy cho cholinephosphotransferase trong microsome tách từ tế bào HeLa khi thử nghiệm trong sự hiện diện của 2,4 mM dioleoylglycerol. Trong trường hợp không thêm diacylglycerol, K_m cho CDP-choline đối với cholinephosphotransferase microsomal chỉ là 38 μM. Việc đưa vào [methyl-¹⁴C]CDP-choline vào phosphatidylcholine được kích thích bởi cung cấp diacylglycerol trong cả tế bào HeLa và microsome tách riêng. Một huyền phù dioleoylglycerol 2,4 mM đã làm tăng gấp bốn lần hoạt động cholinephosphotransferase trong microsome. Các tế bào đã được điều trị với digitonin không thấm qua huyền phù dioleoylglycerol. Việc ươm các tế bào đã được làm thấm với 150 μM acyl-CoA và 0,8 mM glycero-3-phosphate đã làm tăng mức diacylglycerol của tế bào lên gấp ba lần, dẫn đến tỷ lệ tổng hợp phosphatidylcholine tăng gấp đôi. Một ươm tương tự đối với microsome với acyl-CoA đã kích thích tổng hợp phosphatidylcholine tăng gấp đôi. Hơn nữa, việc ươm microsome với [³H]diacylglycerol và [¹⁴C]CDP-choline cho thấy cả hai chất nền đều được đưa vào phosphatidylcholine với cùng một tốc độ. Kết quả này cho thấy rằng các tác động kích thích đối với cholinephosphotransferase xuất phát từ việc tăng sẵn có chất nền thay vì kích hoạt enzyme. Những kết quả này gợi ý rằng cả trong các tế bào đã được thấm và trong màng tách riêng, quá trình sinh tổng hợp phosphatidylcholine có thể bị giới hạn bởi cả CDP-choline và diacylglycerol.

Cấu trúc, động lực học và đặc tính gắn kết DNA của protein ức chế Cro kiểu hoang dã và protein ức chế Cro liên kết chéo được so sánh bằng cách sử dụng phổ vòng dị hướng (CD) và phổ hạt nhân từ tính (NMR). Protein ức chế Cro là một protein DNA gắn kết dimer nhỏ từ phage λ. Việc thay thế valine-55 bằng cysteine tại vùng tương tác của dimer trong mỗi đơn vị monomer dẫn đến sự hình thành tự phát của một liên kết disulfide giữa các đơn vị. Dữ liệu từ phổ hạt nhân Overhauser hiệu ứng hai chiều và CD cho thấy biến thể này có cấu hình gần giống như protein kiểu hoang dã. Tuy nhiên, bằng cách theo dõi băng CD tại 222 nm, protein liên kết chéo cho thấy nhiệt độ điểm cực đại khi bị biến tính do nhiệt là 67 °C, trong khi protein kiểu hoang dã có nhiệt độ nóng chảy khoảng 47 °C. Sử dụng ¹H-NMR để theo dõi sự nóng chảy do nhiệt, nhiệt độ nóng chảy tương tự được quan sát cho protein Cro kiểu hoang dã (47 °C), nhưng nhiệt độ nóng chảy thấp hơn nhiều được thấy cho Cro V55C (58 °C). Điều này gợi ý rằng giữa 58 và 67 °C, protein liên kết chéo tồn tại trong trạng thái globule nóng chảy với α-helix chủ yếu còn nguyên vẹn, nhưng không có sự tương tác của các nhóm hóa học dẫn đến hiện tượng phân tán quang phổ. Các thông số gắn kết cho sự tương tác giữa các protein với DNA được thu được bằng cách quan sát quang phổ NMR cho các proton imino của DNA đoạn một nửa 10 cặp baz và titrat protein vào. Protein liên kết chéo gắn kết DNA (K_d = 160 μM) yếu hơn khoảng tám lần so với protein kiểu hoang dã (K_d = 19 μM). Các điều chỉnh trong cấu trúc protein, cần thiết để tạo thành phức hợp protein-DNA chặt chẽ, dường như bị cản trở bởi sự mất linh hoạt của protein do liên kết giữa các đơn vị. Từ khóa: phổ hạt nhân từ tính, vòng dị hướng, protein ức chế Cro, kỹ thuật protein, liên kết disulfide.

Protein macrophage liên quan đến khả năng kháng tự nhiên (Nramp) đồng hình thành nên một họ các chất vận chuyển liên kết proton giúp hấp thụ các ion kim loại hai hóa trị (Me²⁺, bao gồm Mn²⁺, Fe²⁺, Co²⁺, và Cd²⁺). Họ Nramp, hay còn gọi là chất vận chuyển 11 (SLC11), được bảo tồn ở các sinh vật nhân thực và vi khuẩn. Con người và gặm nhấm biểu hiện 2 gen tương đồng liên quan đến các rối loạn sắt và bệnh miễn dịch. Protein NRAMP1 (SLC11A1) đặc biệt có ở các đại thực bào chuyên nghiệp và giúp loại bỏ Me²⁺ từ phagosome để bảo vệ khỏi vi sinh vật xâm nhập; các biến thể trong gen NRAMP1 có liên quan đến nhiều bệnh miễn dịch khác nhau. Một số isoform của NRAMP2 (SLC11A2, DMT1, DCT1) được biểu hiện ở hầu hết các bộ phận trong các endosome tái chế hoặc đặc biệt tại màng đỉnh của tế bào biểu mô trong ruột và thận, và có thể góp phần vào quá tải sắt, trong khi các đột biến làm suy giảm chức năng NRAMP2 gây ra một dạng thiếu máu vi hồng cầu bẩm sinh. Các nghiên cứu cấu trúc – chức năng, sử dụng các mô hình thí nghiệm khác nhau, và các phương pháp đột biến đã bắt đầu làm rõ tổ chức màng xuyên suốt tổng thể của Nramp, một số đoạn xuyên màng (TMS) có vai trò chức năng quan trọng, và một cơ chế bất thường liên kết giữa vận chuyển Me²⁺ và proton H⁺. Các phương pháp được sử dụng bao gồm bổ sung chức năng các chủng nấm men knockout, phân tích điện sinh lý ở trứng ếch Xenopus, và các thử nghiệm vận chuyển sử dụng tế bào động vật có vú và vi khuẩn cũng như các phép đo trực tiếp và gián tiếp về các đặc tính chất vận chuyển SLC11. Những nghiên cứu bổ sung này đã cho phép xác định TMS1 và TMS6 là các đoạn cấu trúc quan trọng cho sự đồng vận chuyển của Me²⁺ và H⁺, và sẽ giúp phát triển một hiểu biết sâu sắc hơn về cơ chế vận chuyển Nramp và đóng góp của nó vào điều hòa Me²⁺ trong sức khỏe và bệnh tật ở con người.

5-aminolevulinate synthase (ALAS; E.C. 2.3.1.37) xúc tác bước đầu tiên và là bước hạn chế tốc độ trong quá trình tổng hợp heme bên trong ti thể. Hai isozyme của ALAS, được mã hóa bởi hai gen riêng biệt, tồn tại. ALAS1 được biểu hiện phổ biến và cung cấp heme cho cytochromes và các hemoprotein khác. ALAS2 chỉ được biểu hiện trong các tế bào hồng cầu và tổng hợp heme đặc biệt cho hemoglobin. Một cuộc tìm kiếm cơ sở dữ liệu cho các protein có thể bị điều chỉnh bởi nồng độ oxy cho thấy ALAS2 chứa một chuỗi axit amin (LXXLAP trong đó L là leucine, X là bất kỳ axit amin nào, A là alanine và P là proline) không xuất hiện trong ALAS1, có thể bị hydroxyl hóa trong điều kiện bình thường (21% O₂) và nhắm mục tiêu enzyme này để ubiquitination và phân huỷ bởi proteasome. Chúng tôi đã kiểm tra chu trình chuyển hóa protein của ALAS2 trong sự hiện diện của cycloheximide trong các tế bào K562. ALAS2 trong điều kiện bình thường có thời gian chuyển hóa khoảng 36 giờ. Thiếu oxy (1% O₂) và ức chế proteasome làm tăng cả tính ổn định và hoạt động đặc hiệu của ALAS2 (lớn hơn từ 2 đến 7 lần, tương ứng, trong 72 giờ điều trị). Đột biến một proline quan trọng trong chuỗi LXXLAP của ALAS2 cũng làm ổn định protein vượt quá 36 giờ trong điều kiện bình thường. Protein von Hippel-Lindau (vHL) đã được kết tủa miễn dịch với ALAS2 có gắn epitope FLAG được sản xuất trong các tế bào ở điều kiện bình thường nhưng không trong các tế bào bị thiếu oxy, cho thấy rằng ALAS2 bị hydroxyl hóa trong điều kiện bình thường và nhắm mục tiêu cho ubiquitination bởi hệ thống E3 ubiquitin ligase. ALAS2 cũng có thể bị ubiquitin hóa trong điều kiện bình thường bằng cách sử dụng một thử nghiệm ubiquitination trong ống nghiệm. Nghiên cứu hiện tại cung cấp bằng chứng rằng ALAS2 bị phân hủy trong điều kiện bình thường bởi proteasome và con đường prolyl-4-hydroxylase/vHL E3 ubiquitin ligase có thể tham gia.

Quá trình tái gấp và các trung gian của arginine kinase (AK) bị biến tính bởi guanidine hydrochloride (GuHCl) đã được nghiên cứu từ góc độ hoạt tính enzym, độ phát quang nội tại, độ phát quang 1-anilino-8-naphthalenesulfonate (ANS) và phổ phân cực tròn UV xa (CD). Trong quá trình tái gấp AK, cường độ phát quang tăng với sự chuyển dịch màu xanh đáng kể của cực đại phát xạ. Độ nhoè mol của CD tăng gần giống với AK tự nhiên, so với AK hoàn toàn chưa gấp. Trong quá trình tái gấp AK, 2 trung gian tái gấp đã được quan sát tại các nồng độ từ 0.8–1.0 mol/L và 0.3–0.5 mol GuHCl/L. Vị trí đỉnh của phát xạ phát quang và cấu trúc bậc hai của các trạng thái biến đổi này vẫn giữ nguyên tương đối. Cường độ phát quang tryptophan chỉ tăng một chút. Tuy nhiên, cường độ phát quang ANS đã tăng đáng kể, so với cả trạng thái tự nhiên và trạng thái chưa gấp hoàn toàn. Trung gian tái gấp đầu tiên ở nồng độ trong khoảng từ 0.8–1.0 mol GuHCl/L đại diện cho một "cấu trúc trạng thái globule nóng chảy trước" không có hoạt tính. Trung gian thứ hai, ở nồng độ trong khoảng từ 0.3–0.5 mol GuHCl/L, có nhiều đặc điểm cấu trúc giống với AK tự nhiên, bao gồm cấu trúc bậc hai và bậc ba của nó, và đã phục hồi chức năng xúc tác của nó, mặc dù hoạt tính của nó thấp hơn so với AK tự nhiên. Các kết quả hiện tại cho thấy rằng trong quá trình tái gấp AK bị biến tính bởi GuHCl có ít nhất 2 trung gian tái gấp; đồng thời, các kết quả này cung cấp bằng chứng trực tiếp cho cơ chế phân cấp của sự gấp protein.Key words: arginine kinase, biến tính guanidine, tái gấp, trung gian, trạng thái globule nóng chảy.

Sự kết tụ mạnh mẽ đã xảy ra trong quá trình gập lại của arginine kinase (AK) bị biến tính bằng 3 mol GdnHCl/L (GdnHCl, guanidine hydrochloride). Sự phục hồi hoạt động của AK bị biến tính bởi GdnHCl là rất thấp và phụ thuộc vào nồng độ protein trong quá trình gập lại. Đối với AK bị biến tính ở nồng độ 1.2 µmol/L, tỷ lệ phục hồi hoạt động vào khoảng 45.2% so với enzyme tự nhiên, trong khi ở nồng độ 5.2 µmol/L, tỷ lệ phục hồi hoạt động chỉ đạt 20% so với hoạt động tự nhiên. Các chất tẩy rửa không ion như Triton X-100 và Tween 20 (nồng độ ≤100 mmol/L) không chỉ chặn hiệu quả sự kết tụ mà còn cho phép AK bị biến tính phục hồi hầu hết hoạt động tự nhiên của nó. Động lực học hòa tan của các hợp chất kết tụ cho thấy có một giai đoạn khởi phát phụ thuộc vào chất tẩy rửa, nhưng không có sự phụ thuộc khi không có chất tẩy rửa. Sự phục hồi hoạt động rõ rệt có mối quan hệ hợp tác với các chất tẩy rửa trong quá trình gập lại, điều này gợi ý về sự tồn tại của một số tương tác giữa chất tẩy rửa và trung gian gập lại. Dựa trên kết quả nghiên cứu, một sơ đồ gập lại đã được đề xuất.

Các yếu tố tăng trưởng fibroblast (FGFs) đại diện cho một nhóm các yếu tố mitogen polypeptide gây ra nhiều phản ứng khác nhau tùy thuộc vào loại tế bào mục tiêu. Kiến thức về các thụ thể bề mặt tế bào trung gian trong các tác động của FGFs gần đây đã mở rộng đáng kể. Sự phức tạp của họ FGF và các phản ứng gây ra bởi FGF được phản ánh trong sự đa dạng và sự dư thừa của các thụ thể FGF. Trong bài đánh giá này, một số đặc điểm sinh hóa và thuộc tính sinh học của họ FGF và các thụ thể của nó được mô tả và sự biểu hiện của chúng cả trong mô bình thường và trong khối u được thảo luận. Cuối cùng, chúng tôi suy đoán về việc hướng mục tiêu của các tác nhân ức chế sự tăng trưởng đến các khối u thông qua các thụ thể FGF. Từ khóa: yếu tố tăng trưởng fibroblast, thụ thể FGF, proteoglycan heparan sulfate, thụ thể kinase tyrosine, FGF trong chẩn đoán khối u.

Matrigen ngoại bào (ECM) là một yếu tố quyết định trong việc phát triển mô và duy trì sự ổn định của nó. "Môi trường vi mô được thiết kế" trong các mô hình nuôi cấy và in vivo đã chỉ ra rằng ECM kiểm soát sự tăng trưởng, biệt hóa và apoptosis ở các tế bào biểu mô vú (MEC) của chuột và người thông qua một hệ thống thứ bậc các sự kiện phiên mã có liên quan đến sự tương tác phức tạp giữa các con đường tín hiệu hòa tan và vật lý. Hơn nữa, các nghiên cứu này đã chỉ ra rằng các con đường này chỉ đạo và bị ảnh hưởng bởi cấu trúc mô. Cấu trúc mô được điều hướng bởi các tương tác hợp tác giữa các tế bào và có thể được điều chỉnh bởi các yếu tố mô đệm. Do đó, không có gì ngạc nhiên khi sự mất cấu trúc mô và các thay đổi trong các thành phần ECM liên quan đến sự xuất hiện và phát tán của các khối u vú, và sự ác tính liên quan đến những rối loạn trong sự kết dính tế bào, sự thay đổi của các phân tử kết dính và phản ứng mô đệm. Một số bằng chứng hiện nay hỗ trợ giả thuyết rằng quá trình bệnh sinh của ung thư vú được xác định (ít nhất một phần) bởi sự tương tác động lực giữa các tế bào biểu mô ống dẫn, môi trường vi mô và cấu trúc mô (acini). Do đó, để hiểu rõ các cơ chế liên quan đến sự hình thành ung thư, vai trò của môi trường vi mô (ECM cùng với các tế bào mô đệm) đối với cấu trúc mô cần phải được xem xét và nghiên cứu. Để đạt được mục tiêu này, chúng tôi đã thiết lập một mô hình MEC người độc đáo về quá trình hình thành khối u, mô hình này kết hợp với một xét nghiệm nuôi cấy ba chiều, tái hiện nhiều thay đổi di truyền và hình thái quan sát được ở ung thư vú in vivo. Hiện tại, chúng tôi đang sử dụng hệ thống này để hiểu vai trò của môi trường vi mô và cấu trúc mô trong sự tiến triển của ung thư vú.

Kích thích của con đường dẫn truyền tín hiệu Ras-mitogen-activated protein kinase (MAPK) dẫn đến nhiều sự kiện bao gồm sự biểu hiện của các gen ngay từ giai đoạn đầu, c-fos và c-myc. Các mục tiêu ở hạ nguồn của con đường này là các protein kinase mitogen và stress-activated (MSK) 1 và 2, mà là các kinase histone H3. Trong các thử nghiệm preciptitation miễn dịch chromatin, đã chỉ ra rằng phosphorylated H3 do mitogen kích thích liên kết với các gen ngay từ giai đoạn đầu và rằng hoạt động của MSK1/2 và phosphoryl hóa H3 có vai trò trong việc tái cấu trúc nhiễm sắc thể và sao chép các gen này. Trong những tế bào fibroblast biến đổi gen ung thư mà con đường Ras-MAPK hoạt động liên tục, quá trình phosphoryl hóa histone H1 và H3 gia tăng và cấu trúc nhiễm sắc thể của những tế bào này có cấu trúc lỏng lẻo hơn so với các tế bào mẹ. Trong bài tổng quan này, chúng tôi khám phá sự rối loạn điều tiết của con đường Ras-MAPK trong ung thư, với trọng tâm là ung thư vú. Chúng tôi thảo luận về các đặc điểm của MSK1 và 2 và tác động của một con đường Ras-MAPK hoạt động liên tục lên tái cấu trúc nhiễm sắc thể và biểu hiện gen.

Các tế bào trophoblast của nhau thai ở nhiều loài đã phát triển các cơ chế để xâm nhập vào tử cung, bao gồm cả các mạch máu, nhằm thiết lập một quá trình trao đổi phân tử giữa mẹ và thai nhi hiệu quả. Quá trình xâm nhập này được kiểm soát một cách nghiêm ngặt về mặt không gian và thời gian, và ở người, thường kéo dài đến giữa thai kỳ. Các cơ chế chính nằm dưới các bước khác nhau trong quá trình xâm nhập của trophoblast bao gồm (i) sự gắn kết với màng đáy, có khả năng là do liên kết với laminin; (ii) sự tách rời khỏi ma trận màng đáy, một quá trình cần sự có mặt của các oligomere phức hợp trên bề mặt tế bào; và (iii) sự phân hủy các thành phần của màng đáy, do sự tiết ra của các metalloprotease (như collagenase type IV) và protease serine (activator plasminogen). Sự hoạt hóa của các metalloprotease có nguồn gốc từ trophoblast dường như phụ thuộc vào plasmin. Sự xâm nhập của trophoblast tại chỗ được kiểm soát bởi vi môi trường, nhờ vào sự sản xuất cục bộ các yếu tố chống xâm nhập bởi mô quyết định của tử cung. Một trong những yếu tố này là TIMP (chất ức chế mô của metalloprotease), trung hòa các metalloprotease với tỷ lệ mol bằng nhau. Một yếu tố khác là TGF-β (yếu tố tăng trưởng biến đổi-β), có tác dụng kép: nó kích thích sự tiết TIMP-1 bởi trophoblast và các tế bào quyết định, đồng thời thúc đẩy sự phân hóa của các tế bào trophoblast xâm nhập thành các tế bào khổng lồ đa nhân, mà có lẽ là không xâm nhập. Do đó, TGF-β cung cấp sự kiểm soát chính về tính xâm nhập của trophoblast tại chỗ. Sự kiểm soát này bị mất trong một số dạng choriocarcinoma nhất định. Ngược lại với phản ứng của trophoblast bình thường, độ xâm nhập của các tế bào choriocarcinoma JAR và JEG-3 dường như không bị ức chế bởi TGF-β. Thực tế, trong các nghiên cứu ban đầu, các tế bào JAR phản ứng với TGF-β bằng cách tăng cường độ xâm nhập. Nguyên nhân của các hiệu ứng khác biệt của TGF-β lên độ xâm nhập của các tế bào trophoblast bình thường so với ác tính hiện đang được nghiên cứu. Từ khóa: trophoblast, xâm nhập, kiểm soát, choriocarcinoma, yếu tố tăng trưởng biến đổi-β.