Thể tích nanoliter (nanoliter volume) là gì?

Thể tích nanoliter (nanoliter volume, ký hiệu: nL) là thang đo thể tích chất lỏng siêu nhỏ thuộc Hệ đo lường quốc tế (SI), tương ứng với một phần tỷ lít hoặc một phần nghìn microlít. Thang thể tích này giữ vai trò nền tảng trong các công nghệ thao tác chất lỏng chính xác cao, bao gồm công nghệ vi lưu (microfluidics), phân phối chất lỏng tự động và các kỹ thuật phân tích sinh học phân tử hiện đại. Bài viết này trình bày toàn diện về bản chất vật lý, các phương trình thủy động lực học chi phối, phương pháp tạo giọt và ứng dụng thực tiễn của thể tích nanoliter.

Bản chất vật lý và quy đổi đơn vị thể tích nanoliter

Trong hệ thống đo lường quốc tế cũng như Tiêu chuẩn Quốc gia TCVN 7870-1:2010 (tương đương chuẩn quốc tế ISO 80000-1:2009) do Bộ Khoa học và Công nghệ ban hành, tiền tố nano biểu thị cho thừa số $10^{-9}$. Do đó, một nanolít là đơn vị thể tích dẫn xuất từ lít, được xác định thông qua biểu thức:

với $\text{nL}$ là ký hiệu đơn vị nanolít và $\text{L}$ là ký hiệu đơn vị lít. Khi quy đổi sang hệ đo lường chuẩn mét khối, vì một lít tương ứng với $10^{-3}\text{ m}^3$, thể tích một nanolít tương ứng chính xác với:

với $\text{m}^3$ là mét khối. Trong các thực hành phòng thí nghiệm sinh hóa và kỹ thuật y sinh, thể tích nanoliter thường được đối chiếu với các ước số quen thuộc khác. Về mặt hệ thống đơn vị đo lường, một nanolít tương đương với $0.001\text{ }\mu\text{L}$ (microlít), $0.000001\text{ mL}$ (tức $10^{-6}\text{ mL}$), và bằng $1000\text{ pL}$ (picolít). Ở quy mô không gian ba chiều, theo phân tích hình học trong nghiên cứu vi lưu của Shang và cs. (2017), một thể tích nanolít tương ứng với $0.001\text{ mm}^3$ hoặc $10^6\text{ }\mu\text{m}^3$ (tức 1000000 micromét khối).

Để hình dung quy mô hình học, xét một giọt chất lỏng hình cầu lý tưởng có thể tích $V$. Mối liên hệ giữa thể tích và bán kính $r$ của giọt cầu được biểu diễn qua công thức:

với $V$ là thể tích giọt chất lỏng, $\pi$ là hằng số toán học pi, và $r$ là bán kính hình học của giọt. Khi giọt chất lỏng có thể tích $V = 1\text{ nL} = 10^6\text{ }\mu\text{m}^3$, việc giải phương trình trên cho thấy bán kính của giọt đạt giá trị xấp xỉ $r \approx 62\text{ }\mu\text{m}$, tương ứng với đường kính $d = 2r \approx 124\text{ }\mu\text{m}$. Bảng dưới đây tóm tắt các hệ số quy đổi tương đương của thể tích nanoliter sang các đơn vị đo lường liên quan:

Đơn vị quy đổi	Ký hiệu	Giá trị tương đương với 1 nL	Quy mô hình học tương đương
Lít	L	Hệ số $10^{-9}\text{ L}$	Một phần tỷ khối lập phương decimet
Mét khối	m³	Hệ số $10^{-12}\text{ m}^3$	Khối lập phương cạnh 100 micromét
Microlít	µL	Hệ số $0.001\text{ }\mu\text{L}$	Một phần nghìn giọt micropipette thông thường
Mililít	mL	Hệ số $0.000001\text{ mL}$	Một phần triệu ống nghiệm tiêu chuẩn
Picolít	pL	Hệ số $1000\text{ pL}$	Một nghìn giọt in phun siêu nhỏ
Micromét khối	µm³	Hệ số $1000000\text{ }\mu\text{m}^3$	Giọt cầu đường kính 124 micromét

Đặc trưng thủy động lực học ở thang đo nanoliter

Khi chất lỏng thu nhỏ về thể tích nanoliter, các định luật vật lý vĩ mô nhường chỗ cho các hiện tượng vi mô đặc thù. Ở quy mô này, tác động của trọng lực trở nên không đáng kể so với lực căng bề mặt và lực nhớt.

Sự thống trị của lực căng bề mặt và số Bond

Tương quan giữa trọng lực và lực căng bề mặt tác động lên khối chất lỏng được định lượng thông qua số không thứ nguyên Bond (còn gọi là số Eötvös, ký hiệu $Bo$). Biểu thức toán học xác định số Bond có dạng:

với $Bo$ là số Bond, $\Delta\rho$ là độ chênh lệch khối lượng riêng giữa chất lỏng và môi trường xung quanh, $g$ là gia tốc trọng trường, $L$ là kích thước chiều dài đặc trưng (ở đây là đường kính giọt), và $\gamma$ là sức căng bề mặt phân cách pha. Theo tính toán lý thuyết từ các thông số thủy động học trong tổng quan của Shang và cs. (2017), đối với một giọt nước thể tích 1 nL có đường kính đặc trưng khoảng 124 micromét lơ lửng trong không khí, số Bond chỉ đạt giá trị xấp xỉ $Bo \approx 0.002$. Ngay cả trong môi trường pha dầu mang có chất hoạt động bề mặt (nơi sức căng bề mặt phân cách giảm xuống), số Bond vẫn duy trì ở mức rất nhỏ, hoàn toàn thỏa mãn điều kiện $Bo \ll 1$. Do số Bond nhỏ hơn rất nhiều so với 1, trọng lực hoàn toàn bị áp đảo; giọt nanolít luôn tự động thu mình về dạng hình cầu hoàn hảo nhằm cực tiểu hóa năng lượng tự do bề mặt, bất kể hướng tác dụng của trọng trường.

Chế độ chảy tầng và số Reynolds thấp

Trong các thiết bị vi lưu vận chuyển thể tích nanoliter qua các vi kênh dẫn nhân tạo, dòng chảy chịu sự chi phối chặt chẽ của số Reynolds (ký hiệu $Re$). Số Reynolds biểu thị tỷ số giữa lực quán tính và lực nhớt của chất lỏng:

với $Re$ là số Reynolds, $\rho$ là khối lượng riêng của chất lỏng, $v$ là vận tốc dòng chảy trung bình, $D_h$ là đường kính thủy lực của vi kênh, và $\mu$ là độ nhớt động lực học. Theo Nan và cs. (2024), trong hầu hết các vi kênh dẫn thể tích nanolít, số Reynolds luôn duy trì ở mức điển hình dưới 0.1 ($Re < 0.1$). Điều này khẳng định dòng chảy hoàn toàn nằm trong chế độ chảy tầng ổn định (laminar flow). Ở chế độ này, hiện tượng cuộn xoáy hỗn loạn không thể tự phát sinh. Do đó, quá trình trộn lẫn giữa hai dòng chất lỏng thể tích nanolít không diễn ra nhờ đối lưu xoáy mà phụ thuộc thuần túy vào cơ chế khuếch tán phân tử qua mặt phân cách.

Tỷ lệ diện tích bề mặt trên thể tích và động học bay hơi

Tỷ lệ giữa diện tích bề mặt $S$ và thể tích $V$ đối với một giọt cầu bán kính $r$ được xác định theo hệ thức:

với $S$ là diện tích bề mặt ngoài của giọt cầu, $V$ là thể tích giọt cầu, và $r$ là bán kính giọt. Đối với giọt nước thể tích 1 nL có bán kính khoảng 62 micromét, tỷ lệ này đạt xấp xỉ $48000\text{ m}^{-1}$. Theo phân tích của Nan và cs. (2024), tỷ lệ diện tích bề mặt trên thể tích cực lớn ở thang đo vi mô dẫn đến tốc độ truyền nhiệt và động học bay hơi diễn ra rất nhanh. Nếu một giọt nước tự do thể tích 1 nL tiếp xúc trực tiếp với không khí ở điều kiện độ ẩm phòng mà không có màng dầu bao bọc, giọt sẽ nhanh chóng bốc hơi làm biến đổi mạnh nồng độ chất tan sinh học.

Phương pháp tạo và phân phối thể tích nanoliter

Việc thao tác chính xác chất lỏng ở mức thể tích nanolít đòi hỏi các nguyên lý công nghệ vượt ra ngoài các ống hút tự động dạng piston truyền thống.

Công nghệ vi lưu tạo giọt hai pha

Công nghệ vi lưu tạo giọt (droplet microfluidics) sử dụng hệ thống kênh dẫn có kích thước micromet để phân cắt dòng chất lỏng liên tục thành các giọt đơn phân tán (monodisperse droplets). Theo tổng quan của Shang và cs. (2017) và Nan và cs. (2024), có ba cấu trúc vi kênh kinh điển để tạo giọt thể tích nanolít:

• Cấu trúc kênh chữ T (T-junction): Pha phân tán (dung dịch nước chứa mẫu sinh học) di chuyển vuông góc và gặp pha liên tục (dầu mang chất hoạt động bề mặt). Ứng suất cắt cơ học do dòng dầu tạo ra bóp nghẽn đầu dòng nước và làm đứt gãy thành từng giọt riêng rẽ.
• Cấu trúc hội tụ dòng (flow-focusing): Dòng pha phân tán được kẹp đối xứng ở hai bên bởi hai dòng pha liên tục và cùng bị ép đi qua một lỗ thắt hẹp. Cấu trúc này tạo ra trường ứng suất đối xứng cao, cho phép tạo các giọt nanolít có độ đồng đều vượt trội.
• Cấu trúc dòng đồng trục (co-flow): Ống dẫn pha phân tán được lồng đồng tâm bên trong ống dẫn pha liên tục, giọt hình thành ở đầu thoát của ống mao quản trong nhờ sự mất ổn định mao dẫn Rayleigh-Plateau.

Theo đánh giá của Nan và cs. (2024), các chip vi lưu hội tụ dòng hiện đại có thể vận hành ổn định ở tần số tạo giọt từ 1000 đến 10000 giọt mỗi giây (tức phạm vi tần số kilohertz), tạo ra hàng triệu vi khoang phản ứng độc lập chỉ trong vài phút.

Kỹ thuật bắn giọt bằng sóng âm (Acoustic Droplet Ejection)

Để khắc phục hiện tượng bám dính chất lỏng vào đầu côn (pipette tip) và loại bỏ hoàn toàn nguy cơ nhiễm chéo giữa các mẫu phân tích, kỹ thuật bắn giọt bằng sóng âm (Acoustic Droplet Ejection, ADE) đã được phát triển. Nghiên cứu của Hadimioglu và cs. (2016) chỉ rõ nguyên lý hoạt động của phương pháp này:

Hệ thống sử dụng một đầu dò áp điện (piezoelectric transducer) phát ra các xung sóng siêu âm tần số vô tuyến (RF) trong dải tần từ 10 MHz đến 500 MHz. Sóng âm truyền qua đáy đĩa vi thể và được hội tụ chính xác tại mặt phân cách tự do giữa chất lỏng và không khí. Tại tiêu điểm âm học, áp suất bức xạ âm tập trung vượt qua sức căng bề mặt của chất lỏng, đẩy một lượng nhỏ chất lỏng vọt lên trên tạo thành giọt tự do bay thẳng đứng vào đĩa nhận đặt ngược phía trên. Công nghệ này có thể phân phối chính xác các thể tích giọt đơn trong phạm vi từ 2.5 picolít đến 25 nL với hệ số biến thiên (coefficient of variation, CV) từ 2% đến 5%, mà hoàn toàn không tiếp xúc cơ học với mẫu thử.

Phân phối cơ học dịch chuyển dương tự động

Trong các trạm xử lý chất lỏng tự động (automated liquid handlers), phương pháp dịch chuyển dương (positive displacement) sử dụng các piston vi mô bằng thép hoặc gốm tiếp xúc trực tiếp hoặc thông qua đệm khí siêu ngắn để hút và đẩy dung dịch. Theo Torres-Acosta và cs. (2022), các hệ thống này kết hợp với động cơ bước vi sai cho phép phân phối thể tích nanolít từ các ống mao quản thủy tinh với độ lặp lại cao, phục vụ chuẩn bị thư viện giải trình tự thế hệ mới.

Ứng dụng khoa học và công nghệ then chốt

Khả năng kiểm soát chất lỏng ở mức thể tích nanoliter đã tạo ra những bước nhảy vọt trong nhiều ngành khoa học thực nghiệm.

Kỹ thuật PCR kỹ thuật số giọt (ddPCR)

Kỹ thuật PCR kỹ thuật số giọt (Droplet Digital PCR, ddPCR) là một trong những ứng dụng thành công nhất của thể tích nanoliter trong chẩn đoán phân tử. Trong công trình đặt nền móng của Hindson và cs. (2011), hệ thống phân tách một thể tích mẫu phản ứng 20 microlít thành khoảng 20000 giọt nhũ tương nước trong dầu. Mỗi giọt có thể tích xấp xỉ 1 nL (thường dao động từ 0.85 nL đến 1 nL), với đường kính giọt quang học phân bố đồng đều trong khoảng từ 115 micromét đến 120 micromét.

Mỗi giọt nanolít đóng vai trò như một ống phản ứng PCR biệt lập chứa không có hoặc chỉ chứa một hoặc vài phân tử DNA đích. Sau chu trình khuếch đại nhiệt, tín hiệu huỳnh quang của từng giọt được đầu dò quang học quét qua với hai trạng thái: giọt dương tính (phát huỳnh quang) hoặc giọt âm tính (không phát huỳnh quang). Mật độ bản sao ban đầu được tính toán chính xác bằng thống kê Poisson:

với $\lambda$ là số lượng phân tử DNA trung bình trên mỗi giọt, $k$ là số lượng giọt dương tính ghi nhận được, và $n$ là tổng số giọt hợp lệ được đếm. Nhờ cơ chế này, phương pháp đạt độ nhạy tuyệt đối mà không cần sử dụng đường chuẩn ngoại suy. Tại Việt Nam, kỹ thuật ddPCR ở thể tích nanolít hiện đã được đưa vào ứng dụng thực tiễn tại các bệnh viện chuyên khoa huyết học và viện kiểm soát dịch bệnh tuyến cuối nhằm theo dõi tồn lưu tối thiểu của tế bào ung thư máu và phát hiện các đột biến gen kháng thuốc ở nồng độ cực thấp.

Sàng lọc thuốc thông lượng cao (HTS)

Trong ngành công nghiệp dược phẩm, các chiến dịch sàng lọc thông lượng cao (High-Throughput Screening, HTS) đòi hỏi thử nghiệm hàng triệu hợp chất hóa dược với các mục tiêu protein sinh học. Theo phân tích của Torres-Acosta và cs. (2022), việc chuyển đổi thể tích phản ứng từ mức 50 microlít xuống thể tích nanolít trên các đĩa vi thể mật độ giếng cao giúp giảm mức tiêu thụ hóa chất đắt tiền và mẫu protein quý hiếm từ 10 lần đến 100 lần. Việc thu nhỏ thể tích này vừa tiết kiệm ngân sách nghiên cứu vừa tăng tốc độ sàng lọc lên hàng trăm nghìn phản ứng mỗi ngày.

Tinh thể học protein và phát hiện tế bào đơn

Trong tinh thể học tia X cấu trúc sinh học, việc nuôi cấy tinh thể protein đòi hỏi thăm dò hàng nghìn điều kiện kết tủa khác nhau. Thể tích nanoliter cho phép nhà nghiên cứu thiết lập các giọt treo (hanging-drop) hoặc giọt ngồi (sitting-drop) với lượng protein chỉ vài chục nanolít mỗi điều kiện. Đồng thời, trong nghiên cứu phân tích tế bào đơn (single-cell analysis), việc bọc từng tế bào sống vào một giọt nanolít giúp cô lập các chất chuyển hóa và bản phiên mã mRNA, ngăn chặn sự pha loãng nồng độ vào môi trường thể tích lớn.

Công nghệ thao tác	Dải thể tích tối ưu	Cơ chế động lực	Ưu điểm nổi bật	Hạn chế chính
Vi lưu hội tụ dòng	Từ 1 pL đến 10 nL	Ứng suất cắt giữa hai pha lỏng không hòa tan	Tần số tạo giọt cao, độ phân tán kích thước rất thấp	Yêu cầu chất hoạt động bề mặt và pha dầu mang
Bắn giọt âm học (ADE)	Từ 2.5 pL đến 25 nL	Áp suất bức xạ từ sóng siêu âm hội tụ RF	Hoàn toàn không tiếp xúc, không gây nhiễm chéo	Chi phí thiết bị cao, nhạy cảm với độ nhớt chất lỏng
Bơm piston dịch chuyển dương	Từ 10 nL đến 1000 nL	Dịch chuyển cơ học trực tiếp của piston vi mô	Định lượng tốt dung dịch có độ nhớt cao	Tiếp xúc vật lý, nguy cơ bám dính hóa chất

Thách thức kỹ thuật, hiệu chuẩn đo lường và giới hạn áp dụng

Mặc dù mang lại lợi ích to lớn về độ nhạy và tiết kiệm mẫu, thao tác chất lỏng ở mức thể tích nanoliter đối mặt với nhiều rào cản vật lý và đo lường nghiêm ngặt.

Khống chế bay hơi và hấp phụ bề mặt

Do tỷ lệ diện tích bề mặt trên thể tích lớn, giọt nanolít bốc hơi cực nhanh trong không khí mở. Để khắc phục hiện tượng này, kỹ thuật nhũ tương nước trong dầu fluorocarbon kết hợp chất hoạt động bề mặt fluorophilic thường được áp dụng nhằm bao bọc hoàn toàn giọt nước, ngăn chặn sự thất thoát hơi nước trong suốt quá trình thao tác nhiệt. Bên cạnh đó, diện tích tiếp xúc lớn giữa thể tích nanolít và thành ống dẫn dẫn đến hiện tượng hấp phụ protein và nucleic acid không đặc hiệu lên bề mặt vật liệu polymer (như PDMS hoặc polystyrene). Việc xử lý thụ động hóa bề mặt bằng các chất trơ như bovine serum albumin (BSA) hoặc polyethylene glycol (PEG) là yêu cầu kỹ thuật bắt buộc để tránh làm mất chất tan phân tích.

Giới hạn của phương pháp cân khối lượng và giải pháp trắc quang

Theo tiêu chuẩn quốc tế ISO 8655 về kiểm chuẩn thiết bị định lượng thể tích dạng piston, phương pháp cân khối lượng (gravimetric method) là chuẩn đo lường cơ bản cho các thể tích mililít và microlít. Tuy nhiên, Bradshaw và cs. (2005) đã chứng minh rằng phương pháp cân khối lượng gặp giới hạn kỹ thuật không thể vượt qua ở mức thể tích nanolít. Khối lượng của một nanolít nước tinh khiết chỉ tương đương với 1 microgam ($1\text{ }\mu\text{g}$). Ở mức khối lượng này, sai số sinh ra do lực nổi không khí, dòng khí đối lưu vi mô trên đĩa cân, và đặc biệt là tốc độ bay hơi trong quá trình thao tác cân vượt quá giá trị thể tích cần đo.

Để giải quyết bài toán hiệu chuẩn này, Bradshaw và cs. (2005) đã phát triển phương pháp trắc quang tỷ lệ hai bước sóng (dual-dye ratiometric photometry), được chuẩn hóa trong hệ thống đo lường vi tích thể. Phương pháp này sử dụng hai dung dịch thuốc nhuộm có đỉnh hấp thụ quang học phân tách rõ rệt tại bước sóng 520 nm và 730 nm. Bằng cách đo mật độ quang học (optical density) đồng thời ở hai bước sóng này, hệ thống xác định chính xác thể tích thực tế phân phối từ 10 nL đến hàng trăm microlít mà hoàn toàn không phụ thuộc vào sự biến thiên chiều dài đường truyền quang hay sai số bay hơi của cân cơ học.