Real-time RT-PCR (reverse transcription quantitative real-time PCR) là kỹ thuật sinh học phân tử kết hợp giữa phản ứng phiên mã ngược RNA thành cDNA và phản ứng chuỗi polymerase định lượng dựa trên tín hiệu huỳnh quang thời gian thực.
Nguyên lý sinh học phân tử và chu trình nhiệt thời gian thực
Kỹ thuật Real-time RT-PCR (thường viết tắt là RT-qPCR) giữ vị trí tiêu chuẩn vàng trong chẩn đoán virus học và nghiên cứu biểu hiện gen. Quy trình diễn ra qua hai pha phản ứng kế tiếp nhau, có thể thực hiện theo quy trình một bước (one-step) hoặc hai bước (two-step):
- Phiên mã ngược (Reverse Transcription): Enzyme phiên mã ngược (Reverse Transcriptase) sử dụng mồi ngẫu nhiên (random hexamers), oligo-dT hoặc mồi đặc hiệu để tổng hợp chuỗi cDNA bổ sung từ khuôn mẫu RNA sợi đơn ban đầu.
- Khuếch đại chuỗi polymerase: Enzyme Taq DNA polymerase chịu nhiệt thực hiện các chu kỳ nhiệt gồm biến tính tách sợi, bắt cặp mồi đặc hiệu và kéo dài chuỗi tổng hợp bản sao mới.
- Phát hiện huỳnh quang thời gian thực: Tín hiệu huỳnh quang tỷ lệ thuận với số lượng phân tử DNA khuếch đại được ghi nhận tại điểm cuối của mỗi chu kỳ nhiệt, giải phóng khỏi nhu cầu điện di gel phân tích sau PCR.
Hai hệ thống hóa chất phát hiện huỳnh quang chính
Tùy thuộc vào yêu cầu độ nhạy và tính đặc hiệu, có hai phương pháp phát tín hiệu huỳnh quang phổ biến:
| Tiêu chí so sánh | Chất nhuộm gắn xen kẽ (SYBR Green I) | Đầu dò thủy phân đặc hiệu (TaqMan Probe) |
|---|---|---|
| Cơ chế phát tín hiệu | Chất huỳnh quang gắn không đặc hiệu vào rãnh nhỏ của mọi phân tử DNA sợi đôi | Đầu dò oligonucleotide mang chất phát huỳnh quang (Reporter) và chất dập tắt huỳnh quang (Quencher) |
| Tính đặc hiệu | Trung bình; phát tín hiệu cả với sản phẩm phụ không đặc hiệu và primer-dimer | Rất cao; tín hiệu chỉ phát ra khi đầu dò lai chính xác với trình tự đích nội bộ |
| Kiểm tra sản phẩm phụ | Bắt buộc phân tích đường cong nóng chảy (Melting curve analysis) | Không cần phân tích đường cong nóng chảy |
| Khả năng Multiplex PCR | Hạn chế; khó phân biệt nhiều đích trong cùng một giếng phản ứng | Tuyệt vời; có thể gắn các chất phát huỳnh quang khác màu (FAM, VIC, CY5, ROX) để phát hiện đồng thời nhiều gen |
| Chi phí và thiết kế | Chi phí thấp, thiết kế đơn giản, linh hoạt cho nghiên cứu cơ bản | Chi phí cao hơn, đòi hỏi thiết kế tối ưu mồi và đầu dò nghiêm ngặt |
Định lượng tuyệt đối và định lượng tương đối trong RT-qPCR
Để lượng hóa nồng độ phân tử RNA ban đầu, tham số cốt lõi thu nhận từ thiết bị là chu kỳ ngưỡng (Cycle threshold - ký hiệu là hoặc ), là điểm chu kỳ nhiệt mà tại đó cường độ tín hiệu huỳnh quang bắt đầu vượt qua ngưỡng nền phát hiện:
Trong định lượng tuyệt đối, một đường cong chuẩn (standard curve) được thiết lập từ các nồng độ pha loãng bậc mười đã biết chính xác số lượng bản sao. Giá trị của mẫu bệnh phẩm được chiếu vào đường chuẩn để nội suy ra tải lượng virus chính xác trên mỗi mililit mẫu.
Trong định lượng biểu hiện gen tương đối, phương pháp Livak kinh điển tính toán độ biến thiên biểu hiện gen theo công thức , so sánh giữa gen mục tiêu và một gen nội chuẩn tham chiếu (housekeeping gene như GAPDH hoặc ACTB) giữa nhóm bệnh và nhóm chứng khỏe mạnh.
Ứng dụng trọng tâm trong y học và khoa học sự sống
Nhờ độ nhạy siêu việt có thể phát hiện chỉ từ vài bản sao phân tử trong phản ứng, Real-time RT-PCR trở thành công cụ chẩn đoán tuyến đầu phòng chống dịch bệnh truyền nhiễm toàn cầu như SARS-CoV-2, HIV, viêm gan virus B và C, cúm mùa; đồng thời phục vụ giám sát tồn dư bệnh tế bào tối thiểu trong điều trị bệnh bạch cầu và phân tích dấu ấn sinh học ung thư.