Jian Yin1, Nicholas Shackel2, Amany Zekry2, Peter H. McGuinness2, Craig Richards2, Karien Van Der Putten2, Geoffrey W. McCaughan2, Josette Eris1, G. Alex Bishop2
1Department of Renal Medicine, Royal Prince Alfred Hospital, New South Wales, Australia
2Centenary Institute, Royal Prince Alfred Hospital and University of Sydney New South Wales Australia
Tóm tắt
Phản ứng chuỗi polymerase (RT–PCR) trong thời gian thực là phương pháp được lựa chọn để đo lường nhanh chóng và tái sản xuất được nồng độ biểu hiện của cytokine hoặc yếu tố tăng trưởng trong các mẫu nhỏ. Các phương pháp phát hiện huỳnh quang để theo dõi PCR trong thời gian thực bao gồm các mồi huỳnh quang được gán nhãn với thuốc nhuộm báo cáo và thuốc nhuộm quenching, chẳng hạn như các mồi Taqman hoặc Molecular Beacons, và thuốc nhuộm liên kết dsDNA SYBR Green I. Mồi huỳnh quang (Taqman) cho một loạt cytokine và yếu tố tăng trưởng của người và chuột đã được kiểm tra về độ nhạy và so với một phép đo định lượng bằng SYBR Green I sử dụng theo dõi huỳnh quang thời gian thực (Máy phát hiện tuần tự Model 7700 của PE Applied Biosystems). Phép phát hiện SYBR Green I liên quan đến việc phân tích nhiệt độ nóng chảy của sản phẩm PCR và đo lường huỳnh quang ở nhiệt độ tối ưu. Các mồi huỳnh quang cung cấp khả năng phát hiện nhạy và tái lặp của các mục tiêu dao động từ biểu hiện thấp (<10 bản sao/phản ứng) đến cao (>107 bản sao/phản ứng). SYBR Green I cho ra kết quả định lượng tái lặp khi gen mục tiêu được biểu hiện ở mức độ trung bình đến cao (≥1000 bản sao/phản ứng), nhưng không cho ra kết quả định lượng tái lập một cách nhất quán khi gen mục tiêu được biểu hiện ở mức độ thấp. Mặc dù tối ưu hóa nhiệt độ nóng chảy cải thiện tính đặc hiệu của phép phát hiện SYBR Green I, nhưng trong tay chúng tôi, nó không bằng độ nhạy và tính đặc hiệu lặp lại của các mồi huỳnh quang. Phương pháp sau là lựa chọn đầu tiên cho việc đo lường biểu hiện gen ở mức độ thấp, mặc dù SYBR Green I là phương pháp đơn giản và tái lặp để định lượng các gen được biểu hiện ở mức độ trung bình đến cao.
