Luciferase là gì? Các bài báo nghiên cứu khoa học liên quan

Khái niệm luciferase

Luciferase là một nhóm enzyme xúc tác phản ứng oxi hóa luciferin, tạo ra ánh sáng sinh học (bioluminescence) mà không phát nhiệt đáng kể. Enzyme này đóng vai trò trung tâm trong quá trình phát quang của nhiều sinh vật biển và côn trùng, cho phép quan sát tín hiệu ánh sáng trong điều kiện sinh lý tự nhiên.

Cơ chế chung của luciferase dựa trên sự chuyển electron từ luciferin sang oxy phân tử, sinh ra sản phẩm oxyluciferin ở trạng thái kích thích, sau đó giải phóng photon khi về trạng thái cơ bản. Hiệu suất phát quang cao và đặc trưng phát xạ ở bước sóng xác định giúp luciferase trở thành công cụ hữu ích trong sinh học phân tử và y sinh.

• Phát quang nhẹ nhàng, không cần nguồn kích thích ngoại lực.
• Tín hiệu phát quang tỷ lệ thuận với hoạt tính enzyme.
• Có thể định lượng cực nhạy trong khoảng femtomol.

Lịch sử phát hiện và nghiên cứu

Vào năm 1885, nhà hóa học người Pháp Raphaël Dubois lần đầu tiên phân lập hai thành phần cơ bản: luciferin và luciferase từ loài đom đóm Photinus pyralis. Ông đặt nền móng cho lĩnh vực nghiên cứu quang sinh học bằng việc chứng minh phản ứng giữa hai chất này sinh ánh sáng.

Trong thập niên 1960–1970, sự phát triển của kỹ thuật phân tích protein và sắc ký hỗ trợ việc tinh sạch luciferase từ nhiều nguồn khác như vi khuẩn Vibrio harveyi, hải miên Renilla reniformis và tảo phát quang. Các nghiên cứu di truyền phân tử tiếp theo đã xác định trình tự gene mã hóa luciferase, mở đường cho kỹ thuật tác nhân Reporter gene.

Đến cuối thế kỷ 20, luciferase trở thành một trong những reporter mạnh mẽ nhất trong nghiên cứu gen, tế bào và dược phẩm. Năm 1992, Cơ quan Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) công nhận ứng dụng của luciferase trong xét nghiệm nhiễm sắc thể và xác định độc chất, đánh dấu bước tiến lớn trong y sinh công nghệ cao.

Phân loại luciferase

Luciferase được phân loại dựa trên nguồn gốc sinh vật và cơ chất luciferin tương ứng. Mỗi loại enzyme có đặc điểm phát xạ, phụ thuộc vào pH, nhiệt độ và năng lượng liên kết khác nhau, phù hợp với các ứng dụng chuyên biệt.

• Firefly luciferase (Photinus pyralis): phát xạ vàng–vàng lục (~560 nm), phụ thuộc ATP, thường dùng làm reporter gene trong tế bào động vật có vú.
• Renilla luciferase (Renilla reniformis): phát xạ xanh lam (~480 nm), không cần ATP, ưu tiên đo trong dung dịch và mô hình in vitro.
• Gaussia luciferase (Gaussia princeps): trọng lượng nhỏ (~19 kDa), phát xạ xanh (~480 nm), hiệu suất cao, thường ứng dụng trong xét nghiệm tiết nội bào.
• Bacterial luciferase (Vibrio harveyi, V. fischeri): cần FMNH₂ và long-chain aldehyde, phát quang liên tục, tín hiệu yếu hơn nhưng thích hợp cho đo liên tục.

Loại	Bước sóng phát xạ (nm)	Phụ thuộc ATP	Kích thước (kDa)
Firefly	~560	Có	61
Renilla	~480	Không	36
Gaussia	~480	Không	19
Bacterial	~490	Không (FMNH2)	77 (α+β)

Cấu trúc phân tử và cơ chế hoạt động

Luciferase từ đom đóm là protein đơn phân chứa khoảng 550 amino acid, có khối lượng phân tử ~61 kDa. Cấu trúc không gian ba chiều gồm hai miền chính, mỗi miền chứa vùng gấp β-barrel tạo vị trí gắn luciferin và ATP.

Cơ chất luciferin và ATP gắn vào vị trí hoạt động, sau đó enzyme xúc tác chuyển hóa luciferin thành luciferyl adenylate, phản ứng tiếp với O₂ tạo peroxy-intermediate, cuối cùng hình thành oxyluciferin trong trạng thái kích thích. Khi oxyluciferin chuyển về trạng thái cơ bản, năng lượng dư phát ra dưới dạng photon:

$\ce{Luciferin + ATP ->[Luciferase] Luciferin{-}AMP + PP_i}$
$\ce{Luciferin{-}AMP + O2 -> Oxyluciferin^* + AMP + CO2}$
$\ce{Oxyluciferin^* -> Oxyluciferin + hν}$

Cấu trúc của Renilla luciferase nhỏ gọn hơn, gồm ~311 amino acid, tạo khung α/β duy nhất cho phản ứng oxi hóa coelenterazine, sinh ánh sáng ở bước sóng ngắn hơn. Bacterial luciferase là heterodimer α/β, dựa vào FMNH₂ và aldehyde dài chuỗi để sinh quang.

• Vùng gấp β-barrel tạo buồng phản ứng kín, giảm tổn thất năng lượng.
• Nhóm amino acid như His, Glu, Lys hỗ trợ hoạt hóa luciferin và ổn định gốc tự do.
• Phụ thuộc cofactor (ATP, FMNH₂) xác định ứng dụng và cảm biến sinh học.

Ứng dụng trong sinh học phân tử

Luciferase được sử dụng rộng rãi làm reporter gene trong nghiên cứu biểu hiện gen. Khi gene luciferase được gắn vào vùng promoter hoặc enhancer của gene mục tiêu, hoạt tính luciferase tỷ lệ thuận với mức độ hoạt động của promoter, cho phép định lượng chính xác cường độ phiên mã trong tế bào sống hoặc mẫu mô.

Trong nghiên cứu dược phẩm, xét nghiệm dựa trên luciferase giúp sàng lọc nhanh hàng ngàn hợp chất để đánh giá độc tính tế bào hoặc điều hòa tín hiệu nội bào. Thử nghiệm cytotoxicity sử dụng tế bào biểu hiện luciferase đo tín hiệu phát quang còn lại để đánh giá khả năng sinh tồn sau điều trị, độ nhạy có thể đạt ngưỡng 10⁻⁵ tế bào/nghĩa nhỏ hơn máy màu sắc thông thường .

• Sàng lọc thuốc (HTS): luciferase reporter assays cho phép xác định chất ức chế hoặc hoạt hóa gene.
• Đo lường biểu hiện gene theo thời gian thực (real-time): theo dõi động học promoter.
• Hình ảnh in vivo: theo dõi phân bố tế bào ung thư hoặc tế bào gốc mang vector luciferase trong động vật mô hình.

Phương pháp đo quang phát quang

Phương pháp phổ biến nhất là dùng máy đo luminometer, đo số photon phát ra trên mỗi giây (RLU – Relative Light Units). Các thiết bị hiện đại cho phép đọc nhanh mẫu đơn (microplate) hoặc chuỗi mẫu tự động với thời gian xử lý dưới 1 giây/mẫu và độ tái lập CV < 5%.

Trong nghiên cứu in vivo, hệ thống chụp ảnh quang phát quang (bioluminescence imaging) như IVIS Spectrum (PerkinElmer) hoặc Lago X (Spectral Instruments Imaging) cho phép quan sát tín hiệu luciferase xuyên mô động vật, bước sóng phát xạ và độ nhạy được tối ưu hóa bằng bộ lọc quang học chuyên dụng .

Thiết bị	Loại mẫu	Phạm vi bước sóng (nm)	Độ nhạy
Microplate Luminometer	Cell lysate	400–700	10−18 mol
IVIS Spectrum	Chuột sống	500–800	103–104 photons/s
Lago X	Chuột sống	450–650	103 photons/s

Kỹ thuật cải tiến và biến thể

Tối ưu hóa codon cho phép biểu hiện luciferase mạnh hơn trong tế bào động vật có vú, giảm thiểu hình thành cấu trúc bậc hai gây bất hoạt enzyme. Phiên bản Luc2 và hLuc+ là những ví dụ luciferase đom đóm được chỉnh sửa để tăng độ ổn định và tín hiệu phát quang dài lâu hơn trong môi trường tế bào.

Luciferase ánh sáng đỏ (red-shifted) như PpyRE9 và Click Beetle Red phát xạ tại 600–700 nm, giúp tín hiệu xuyên mô sâu hơn và giảm nhiễu từ autofluorescence. Ngoài ra, NanoLuc (Promega) là luciferase nhỏ (~19 kDa) sử dụng cơ chất furimazine, cho tín hiệu gấp 150 lần firefly luciferase và ổn định trong thời gian dài.

• Codon optimization: tăng biểu hiện và ổn định protein.
• Red-shifted variants: PpyRE9, CBR, tối ưu cho chụp ảnh mô dày.
• NanoLuc: kích thước nhỏ, hiệu suất cao, dùng furimazine.
• Dual-luciferase: kết hợp Firefly và Renilla để kiểm soát nội bộ.

So sánh ưu nhược điểm

Firefly luciferase có độ nhạy cao và tín hiệu bền, phù hợp với hầu hết ứng dụng reporter gene nhưng phụ thuộc ATP nội bào, không thích hợp với mô trường thiếu hụt năng lượng. Renilla luciferase không cần ATP, tín hiệu phát nhanh nhưng suy giảm nhanh hơn so với Firefly, thích hợp cho thử nghiệm động học ngắn hạn.

Bacterial luciferase phát quang liên tục mà không cần ATP nhưng yêu cầu cofactor FMNH₂ và aldehyde dài chuỗi, tín hiệu yếu hơn. NanoLuc có ưu điểm kích thước nhỏ, hiệu suất phát quang cực cao và ổn định, song chi phí cơ chất furimazine cao và bước sóng phát quang ngắn (460 nm) giới hạn ứng dụng in vivo sâu.

Danh sách tài liệu tham khảo

1. Promega Corporation. “Luciferase Reporter Assays.” https://www.promega.com/products/reporter-assays-and-transfection/reporter-assays/luciferase-assays/.
2. PerkinElmer. “In Vivo Imaging Systems.” https://www.perkinelmer.com/category/in-vivo-imaging.
3. Thermo Fisher Scientific. “Bioluminescence Assays: Principles and Protocols.” https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/protein-biology/protein-assays-analysis/bioluminescence-assays.html.
4. Badring, A. et al. (2019). “Advances in Luciferase-based Reporter Gene Assays.” Journal of Biomolecular Screening, 24(2), 123–135.
5. Hall, M. P. et al. (2012). “Engineered luciferase reporter from a deep sea shrimp utilizing a novel imidazopyrazinone substrate.” ACS Chemical Biology, 7(11), 1848–1857.