H S Chen1, Shuichi Kaneko1, Rosina Gironés1, Ronald Anderson1, William E. Hornbuckle1, Bud C. Tennant1, Paul J. Côté1, John L. Gerin1, Robert H. Purcell1, R.H. Miller1
1Hepatitis Viruses Section, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, Bethesda, Maryland 20892.
Tóm tắt
Tất cả các loại virus viêm gan động vật có vú đều có một gen, được gọi là X, mã hóa một protein có khả năng hoạt hóa biểu hiện gen của virus. Gen X chồng lấp các gen polymerase và precore cũng như hai khung đọc mở (ORF) mới được xác định, được gọi là ORF5 và ORF6. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã kiểm tra xem liệu ORF5, ORF6 và gen X có quan trọng cho việc nhân bản của virus viêm gan chồn đất (WHV) trong các con chồn đất nhạy cảm không. Đầu tiên, chúng tôi đã kiểm tra xem liệu các protein có được sản xuất từ ORF5 và ORF6 qua dịch mã in vitro của các bản sao virus phù hợp hay không, tìm kiếm kháng thể chống lại các protein giả định trong huyết thanh của các động vật bị nhiễm virus dạng hoang dã, và tìm kiếm một bản sao chuyển mã WHV antisense, cần thiết cho việc biểu hiện một protein từ ORF6, trong gan của các chồn đất bị nhiễm cấp tính hoặc mãn tính. Tất cả các thí nghiệm đó đều cho kết quả âm tính. Tiếp theo, chúng tôi sử dụng đột biến theo hướng oligonucleotide để giới thiệu các mã kết thúc vào ORF5 và ORF6 ở hai vị trí trong mỗi ORF. Các chồn đất trưởng thành được chia thành các nhóm ba con, được chuyển gen với một trong bốn bộ gen đột biến. Tất cả các chồn đất này phát triển nhiễm WHV không thể phân biệt được với các động vật được chuyển gen với WHV dạng hoang dã. Khuếch đại phản ứng chuỗi polymerase và giải trình tự DNA trực tiếp xác nhận rằng sự tái trở lại của các đột biến thành kiểu gen dạng hoang dã đã không xảy ra. Tổng hợp lại, những dữ liệu này chỉ ra rằng ORF5 và ORF6 không cần thiết cho sự nhân bản của virus và không có khả năng đại diện cho các gen xác thực. Cuối cùng, chúng tôi đã tạo ra năm đột biến gen WHV X mà hoặc là loại bỏ codon khởi đầu cho tổng hợp protein hoặc làm cắt bớt đầu carboxyl của protein theo 3, 16, 31, hoặc 52 axit amin. Các nhóm ba chồn đất trưởng thành được chuyển gen với một trong năm đột biến gen X. Chỉ các đột biến mang gen X thiếu 3 axit amin từ đầu carboxyl có khả năng nhân bản trong khung thời gian 6 tháng của thí nghiệm. Ngược lại, tất cả bảy chồn đất được chuyển gen WHV dạng hoang dã phát triển chỉ số phù hợp với nhiễm virus. Do đó, rất có khả năng (P < 0,01) rằng gen X của WHV là quan trọng cho sự nhân bản virus trong vật chủ tự nhiên.
