Nghiên cứu phổ hạt nhân từ tính về độ affin của protein ức chế Cro gắn kết với DNA được ổn định bằng liên kết disulfide

Cấu trúc, động lực học và đặc tính gắn kết DNA của protein ức chế Cro kiểu hoang dã và protein ức chế Cro liên kết chéo được so sánh bằng cách sử dụng phổ vòng dị hướng (CD) và phổ hạt nhân từ tính (NMR). Protein ức chế Cro là một protein DNA gắn kết dimer nhỏ từ phage λ. Việc thay thế valine-55 bằng cysteine tại vùng tương tác của dimer trong mỗi đơn vị monomer dẫn đến sự hình thành tự phát của một liên kết disulfide giữa các đơn vị. Dữ liệu từ phổ hạt nhân Overhauser hiệu ứng hai chiều và CD cho thấy biến thể này có cấu hình gần giống như protein kiểu hoang dã. Tuy nhiên, bằng cách theo dõi băng CD tại 222 nm, protein liên kết chéo cho thấy nhiệt độ điểm cực đại khi bị biến tính do nhiệt là 67 °C, trong khi protein kiểu hoang dã có nhiệt độ nóng chảy khoảng 47 °C. Sử dụng ¹H-NMR để theo dõi sự nóng chảy do nhiệt, nhiệt độ nóng chảy tương tự được quan sát cho protein Cro kiểu hoang dã (47 °C), nhưng nhiệt độ nóng chảy thấp hơn nhiều được thấy cho Cro V55C (58 °C). Điều này gợi ý rằng giữa 58 và 67 °C, protein liên kết chéo tồn tại trong trạng thái globule nóng chảy với α-helix chủ yếu còn nguyên vẹn, nhưng không có sự tương tác của các nhóm hóa học dẫn đến hiện tượng phân tán quang phổ. Các thông số gắn kết cho sự tương tác giữa các protein với DNA được thu được bằng cách quan sát quang phổ NMR cho các proton imino của DNA đoạn một nửa 10 cặp baz và titrat protein vào. Protein liên kết chéo gắn kết DNA (K_d = 160 μM) yếu hơn khoảng tám lần so với protein kiểu hoang dã (K_d = 19 μM). Các điều chỉnh trong cấu trúc protein, cần thiết để tạo thành phức hợp protein-DNA chặt chẽ, dường như bị cản trở bởi sự mất linh hoạt của protein do liên kết giữa các đơn vị. Từ khóa: phổ hạt nhân từ tính, vòng dị hướng, protein ức chế Cro, kỹ thuật protein, liên kết disulfide.