Realtime rt pcr là gì? Các công bố khoa học về Realtime rt pcr
Realtime RT-PCR là kỹ thuật sinh học phân tử quan trọng dùng để phát hiện và định lượng RNA qua quá trình phiên mã ngược thành DNA và khuếch đại DNA bằng PCR. Ứng dụng rộng rãi trong chẩn đoán bệnh truyền nhiễm, nghiên cứu biểu hiện gen và đo tải lượng virus. Quy trình gồm các bước: chiết xuất RNA, phiên mã ngược, khuếch đại PCR và phân tích dữ liệu. Lợi ích là kết quả nhanh, chính xác và độ nhạy cao, nhưng có chi phí cao và yêu cầu kỹ thuật viên tay nghề cao. Dù có hạn chế, Realtime RT-PCR vẫn là công cụ quan trọng trong nghiên cứu và y học.
Realtime RT-PCR: Khái Niệm và Nguyên Tắc Cơ Bản
Realtime RT-PCR, hay còn gọi là phản ứng chuỗi polymerase thời gian thực phiên mã ngược, là một kỹ thuật sinh học phân tử được sử dụng rộng rãi để phát hiện và định lượng RNA. Phương pháp này kết hợp giữa phiên mã ngược RNA thành DNA (cDNA) và khuếch đại DNA đích thông qua PCR, trong khi quá trình khuếch đại xảy ra, thông tin được ghi lại theo thời gian thực.
Ứng Dụng của Realtime RT-PCR
Kỹ thuật realtime RT-PCR được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau của khoa học đời sống. Một số ứng dụng chính bao gồm:
- Chẩn đoán bệnh truyền nhiễm: Được sử dụng để phát hiện các tác nhân gây bệnh như virus và vi khuẩn.
- Nghiên cứu biểu hiện gen: Cho phép định lượng sự biểu hiện của gen trong các mẫu sinh học.
- Đo lường nồng độ virus: Được sử dụng để định lượng tải lượng virus trong các nghiên cứu và điều trị bệnh.
Nguyên Lý Hoạt Động Của Realtime RT-PCR
Kỹ thuật realtime RT-PCR hoạt động dựa trên hai giai đoạn chính: phiên mã ngược RNA thành DNA, và khuếch đại DNA bằng PCR. Trong quá trình PCR, một đầu dò huỳnh quang hoặc thuốc nhuộm huỳnh quang đặc hiệu liên kết với DNA. Khi DNA được khuếch đại, tín hiệu huỳnh quang được phát ra và đo lường theo thời gian thực. Điều này cho phép ghi lại dữ liệu định lượng trong suốt quá trình thí nghiệm.
Các Bước Thực Hiện Realtime RT-PCR
Các bước chính trong một quy trình realtime RT-PCR bao gồm:
- Chiết xuất RNA: Từ mẫu sinh học, RNA được chiết xuất và tinh sạch.
- Phiên mã ngược: RNA được chuyển đổi thành cDNA sử dụng enzyme phiên mã ngược.
- Khuếch đại PCR thời gian thực: cDNA được sử dụng làm khuôn mẫu cho PCR, trong đó DNA được khuếch đại và tín hiệu huỳnh quang được đo theo thời gian thực.
- Phân tích dữ liệu: Sử dụng phần mềm để phân tích đồ thị khuếch đại và kết quả định lượng.
Lợi Ích và Hạn Chế Của Realtime RT-PCR
Lợi ích:
- Cung cấp kết quả nhanh chóng và chính xác.
- Khả năng định lượng RNA với độ nhạy cao.
- Độ đặc hiệu cao nhờ sử dụng các đầu dò huỳnh quang.
Hạn chế:
- Chi phí tương đối cao do cần thiết bị và hóa chất đặc biệt.
- Yêu cầu kỹ thuật viên có tay nghề cao để thực hiện các thí nghiệm chính xác.
- Dễ bị ảnh hưởng bởi các yếu tố ngoại cảnh như chất ức chế PCR.
Kết Luận
Realtime RT-PCR là một công cụ mạnh mẽ trong nghiên cứu sinh học phân tử và y học. Mặc dù có một số hạn chế, nhưng với những lợi ích vượt trội về độ chính xác và thời gian, nó vẫn đóng vai trò quan trọng trong những ứng dụng từ nghiên cứu khoa học đến chẩn đoán y tế.
Danh sách công bố khoa học về chủ đề "realtime rt pcr":
PHÁT TRIỂN PHƯƠNG PHÁP RT-PCR ĐA MỒI ĐỂ PHÁT HIỆN VIRUS GÂY BỆNH DỊCH TẢ LỢN CHÂU PHI VÀ VIRUS GÂY BỆNH DỊCH TẢ LỢN CỔ ĐIỂN
Virus dịch tả lợn Châu Phi (ASFV) và virus dịch tả lợn cổ điển (CSFV) đã gây thiệt hại kinh tế rất lớn cho người chăn nuôi lợn. Có nhiều phương pháp xét nghiệm để phát hiện hai virus này như: PCR, Realtime PCR, phân lập virus, ELISA. Bên cạnh đó phương pháp Multiplex Real-time RT-PCR (mReal-time RT-PCR) để phát hiện đồng thời ASFV và CSFV cũng đã được đánh giá ở một số nước trên thế giới nhưng chưa được nghiên cứu nhiều tại Việt Nam. Trong nghiên cứu này chúng tôi đánh giá mReal-time RT-PCR để xét nghiệm phát hiện đồng thời ASFV và CSFV. Kết quả cho thấy giới hạn phát hiện của phương pháp là 12,5×101 copies/µL đối với ASFV và CSFV. Kiểm tra độ lặp lại bằng cách sử dụng mẫu chuẩn (p-ASFV và p-CSFV) cho thấy hệ số biến đổi giữa các lần lặp lại <2%. Áp dụng xét nghiệm 90 mẫu thực địa thu thập từ năm 2019-2022 với kết quả tỷ lệ dương tính ASFV và CSFV là 42,22% và 8,89% theo thứ tự; đồng cảm nhiễm ASFV và CSFV là 2,2%.
#mRealtime RT-PCR #sRealtime RT-PCR #ASFV #CSFV
Ứng dụng kỹ thuật realtime RT - PCR để định lượng Serpine1 - MRNA nguồn gốc nhau thai trong huyết tương của thai phụ và khảo sát mối liên quan với tiền sản giật - sản giật
Đặt vấn đề: Khảo sát mRNA nhau thai trong huyết tương thai phụ là một phương pháp không xâm nhập, có giá trị dự báo nguy cơ tiền sản giật – sản giật. Nghiên cứu này nhằm mục tiêu: (1) Bước đầu áp dụng kỹ thuật Realtime RT-PCR để định lượng mRNA của gene SERPINE1 trong huyết tương của các phụ nữ mang thai; (2) Khảo sát mối liên quan giữa sự biểu hiện gene SERPINE1 ở mức mRNA với tiền sản giật – sản giật. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: 180 thai phụ có tuổi thai từ 16-24 tuần được theo dõi đến lúc sinh và 6 tuần sau sinh. mRNA của gene SERPINE1 (gene đích) và gene GAPDH (gene chứng) được định lượng bằng kỹ thuật Realtime RT-PCR với RNA được tách từ huyết tương của thai phụ. Kết quả: 98,9% mẫu có GAPDH mRNA dương tính với nồng độ trung bình 4,45 x 105 ± 1,40 x 106 copy/ ml; 21,9% mẫu có SERPINE1 mRNA dương tính, nồng độ trung bình 2,71 x 104 ± 4,57 x 104 copy/ml. Thai phụ có SERPINE1 mRNA dương tính có nguy cơ mắc TSG – SG cao gấp 4,8 lần (95%CI: 1,8 – 12,9) so với thai phụ có SERPINE1 mRNA âm tính. Nếu xem xét thêm yếu tố nồng độ mRNA gene chứng GAPDH cao từ 104 copy/ ml trở lên thì nguy cơ này cao gấp 4,9 lần (95%CI: 1,3 – 17,7). Tỷ số SERPINE1 mRNA / GAPDH mRNA ở nhóm có TSG – SG là 0,120 ± 0,125; cao hơn có ý nghĩa thống kê so với nhóm không có TSG – SG (0,036 ± 0,029), p = 0,0012. Xác suất dự báo đúng TSG – SG cho một thai phụ có tỷ số này cao là 81,5% (95%CI: 65,8 – 92,1%), với điểm cắt của tỷ số này > 0,0596 thì độ nhạy và độ đặc hiệu lần lượt là 75% và 77,42%. Kết luận: Chúng tôi đã ứng dụng thành công quy trình định lượng SERPINE1 mRNA bằng kỹ thuật Realtime RT-PCR. Sự biểu hiện gene SERPINE1 ở mức mRNA có thể là một yếu tố giúp dự báo nguy cơ TSG – SG.
#Tiền sản giật #SERPINE1 mRNA
Ứng dụng kỹ thuật realtime RT – PCR để định lượng FLT-1 mRNA nguồn gốc nhau thai trong huyết tương của thai phụ và khảo sát mối liên quan với tiền sản giật – sản giật
Đặt vấn đề: Khảo sát mRNA nhau thai trong huyết tương thai phụ là một phương pháp không xâm nhập, có giá trị dự báo nguy cơ tiền sản giật – sản giật.
Nghiên cứu này nhằm mục tiêu: (1) Bước đầu áp dụng kỹ thuật Realtime RT-PCR để định lượng FLT-1 mRNA có nguồn gốc nhau thai trong huyết tương của các phụ nữ mang thai; (2) Khảo sát mối liên quan giữa sự biểu hiện FLT-1 mRNA với tiền sản giật – sản giật.
Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: 398 thai phụ có tuổi thai từ 16-24 tuần được theo dõi đến lúc sinh và 6 tuần sau sinh. mRNA của gene FLT-1 (gene đích) và gene GAPDH (gene chứng) được định lượng bằng kỹ thuật Realtime RT-PCR với RNA được tách từ huyết tương của thai phụ.
Kết quả: Tỷ lệ mẫu có FLT-1 mRNA dương tính là 10,05%, tỷ lệ này đạt 12,46% trong nhóm có nồng độ GAPDH mRNA từ 104 copy/ml trở lên. Nồng độ trung bình của FLT-1 mRNA là 1,54 x 104 ± 2,12 x 104 copy/ml. Tỷ số FLT-1 mRNA / GAPDH mRNA là 0,017 ± 0,043. Nguy cơ mắc TSG – SG khi có một thai phụ có FLT-1 mRNA dương tính cao gấp 2,33 lần (95%CI: 1,01 – 5,39) so với thai phụ có FLT-1 mRNA âm tính. Nếu xem xét thêm yếu tố nồng độ GAPDH mRNA cao từ 104 copy/ ml trở lên thì nguy cơ này cao gấp 2,48 lần (95%CI: 1,04 – 5,92). Tỷ số FLT1 mRNA / GAPDH mRNA ở nhóm TSG – SG cao hơn nhóm không có TSG – SG, lần lượt là 0,069 ± 0,09 và 0,008 ± 0,016 (p = 0,0009). Tỷ FLT-1 mRNA / GAPDH mRNA có giá trị trong dự báo TSG – SG với xác suất đúng là 70,1%, điểm cắt tối ưu > 0,0106, độ nhạy và độ đặc hiệu tương ứng lần lượt là 66,67% và 82,35%.
Kết luận: Chúng tôi đã ứng dụng thành công quy trình định lượng FLT-1 mRNA bằng kỹ thuật Realtime RT-PCR. Sự biểu hiện gene FLT-1 ở mức mRNA có thể là một yếu tố giúp dự báo nguy cơ TSG – SG.
#Tiền sản giật #FLT-1 mRNA .
XÁC NHẬN GIÁ TRỊ SỬ DỤNG XÉT NGHIỆM PHÁT HIỆN SARS-COV-2 BẰNG PHƯƠNG PHÁP REALTIME RT-PCR
Tạp chí Y học Việt Nam - Tập 521 Số 2 - 2022
‘Tiêu chuẩn vàng’ cho chẩn đoán xác định ca nhiễm SARS-CoV-2 là xét nghiệm phát hiện vật liệu di truyền của virus bằng kĩ thuật Realtime RT-PCR. Với các đặc tính kỹ thuật phức tạp, xét nghiệm Realtime RT-PCR cần được xác nhận và kiểm soát được chất lượng nghiêm ngặt. Mục tiêu: Kiểm tra xác nhận giá trị sử dụng bộ sinh phẩm Allplex™ SARS-CoV-2-Seegenee tại PXN Hóa sinh thuộc Bệnh viện hữu nghị Việt-Tiệp, Hải Phòng. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Tiến hành xác nhận các thông số độ chụm ngắn hạn, độ chụm dài hạn, độ chính xác của bộ sinh phẩm Allplex™ SARS-CoV-2-Seegenee theo hướng dẫn của tổ chức ASM. Kết quả: Độ chụm của xét nghiệm đạt giá trị CV% cho độ chụm ngắn hạn và độ chụm dài hạn đánh giá trên từng gen đích phù hợp với tiêu chuẩn của nhà sản xuất. Độ chính xác của xét nghiệm có độ đồng thuận dương tính, âm tính đạt 100%. Kết luận: Kiểm tra xác nhận giá trị sử dụng phương pháp phù hợp với tuyên bố của nhà sản xuất.
#SARS-CoV-2 #xác nhận phương pháp #Realtime RT-PCR #validation #verification #ASM.
A comparison of SARS-CoV-2 rapid antigen testing with realtime RT-PCR among symptomatic and asymptomatic individuals
BMC Infectious Diseases - Tập 23 - Trang 1-6 - 2023
Identification of SARS-CoV-2 positive patients with rapid and cost-effective test methods is the key for isolating infected individuals, interrupting the transmission chain, and thus, containment of the CoVID-19 disease. In this regard, Rapid Antigen Test (RAT) plays an important role at point of care testing but the low sensitivity attributing towards escape of positive cases is reported as a major disadvantage of RAT which led us to evaluate a RAT kit among symptomatic and asymptomatic individuals suspected of CoVID-19. We analyzed 329 parallel nasopharyngeal swabs for RAT (Zydus Cadila, India) at the point of collection in a hospital-based facility and RealTime RT-PCR in the laboratory. The performance parameters were analyzed by evaluating the specificity, sensitivity, Negative Predictive Value (NPV), Positive Predictive Value (PPV), and Kappa coefficient. The sensitivity and specificity were found to be 75.17% and 98.89% respectively. Positive Predictive value was 98.25% and the negative predictive value was 82.79%. The accuracy between the two techniques was found to be 88.14% with a kappa coefficient of 0.756 (SE: 0.036 and CI at 95%: 0.686 to 0.826) with a good strength of agreement (0.61–0.80) between the two testing techniques. Among the false-negative cases, 22 (59.5%) were asymptomatic having the Cycle Threshold (Ct) range 27 to 32.9 including 12 cases with a history of close contact with the known positive cases (i.e. household contact). The remaining 15 cases (40.5%) were symptomatic having low to moderate Ct values. It is observed from the results that the false negative result for symptomatic individuals is a matter of concern as it was noted in 4 cases of our study subjects who required hospitalisation later. Also the positives among asymptomatic contacts are important from epidemiological point of view for isolation and curtailing the infection from spreading in a community. These results support the fact that RAT showing sensitivity below 80% can be used for mass screening purposes with provision for additional testing in case of false negative with symptomatic individuals. Also false-negative results should be interpreted cautiously considering the epidemiological link as well as the clinical condition of the patients.
Evaluation of the analytical performance of the new Abbott RealTime RT-PCRs for the quantitative detection of HCV and HIV-1 RNA
Journal of Clinical Virology - Tập 40 - Trang 99-104 - 2007
ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ CHẨN ĐOÁN BA BỘ KIT REALTIME RT-PCR PHÁT HIỆN SARS-COV-2
Mở đầu: Phương pháp realtime RT - PCR là kỹ thuật phát hiện SARS-CoV-2 đang được phát triển bởi nhiều phòng nghiên cứu và công ty sản xuất kit chẩn đoán. Các bộ sinh phẩm lựa chọn các vùng gen đích khác nhau cho độ nhạy chẩn đoán khác nhau.
Mục tiêu: Nghiên cứu thực hiện với mục tiêu so sánh và đánh giá hiệu quả phát hiện SARS-CoV-2 bằng kỹ thuật realtime RT - PCR trên 3 bộ kit RealStar-SARS-CoV-2 (Altona Diagnostics, Đức), kit AV - LDA do phòng nghiên cứu phát triển và kit WHO RT - PCR (Berlin - Charite, Đức).
Vật liệu và phương pháp: Tổng số 73 mẫu dịch mũi họng của bệnh nhân dương tính SARS-CoV-2 bằng kỹ thuật real - time RT - PCR theo qui trình của WHO và người nghi nhiễm được thu thập và tiến hành tách chiết RNA tổng số. Đánh giá ba bộ kit Realtime RT - PCR phát hiện SARS-CoV-2 trên hệ thống máy realtime PCR LightCycler 480 II. Đánh giá độ nhạy, sự phù hợp trong phát hiện bằng các thuật toán hồi qui tuyến tính và biểu đồ Bland - Altman.
Kết quả: Cả 3 bộ kit đều cho độ nhạy chẩn đoán 100% với SARS-CoV-2. Kết quả đánh giá cho thấy cả 3 bộ kit có sự tương quan cao trong xác định SARS-CoV-2 khi phân tích bằng hệ số tương quan và phân tích biểu đồ Bland - Altman theo từng cặp kit với nhau cho thấy không có sự khác biệt về giá trị Ct trung bình giữa các bộ kit. Như vậy, kết quả đánh giá cho thấy cả 3 bộ kit đều có độ chính xác cao trong xét nghiệm chẩn đoán nhiễm SARS-CoV-2.
#COVID-19 #SARS-CoV-2 #realtime RT - PCR
Xây dựng quy trình realtime RT-PCR phát hiện Zika và Chikungunya
TẠP CHÍ Y DƯỢC LÂM SÀNG 108 - - 2021
Mục tiêu: Xây dựng quy trình realtime RT-PCR phát hiện Zika (ZIKV) và Chikungunya (CHIKV). Đối tượng và phương pháp: Mẫu chứng dương ZIKV do NIHE, CHIKV do Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) cung cấp và các virus khác được sử dụng trong nghiên cứu này. Để đánh giá ngưỡng phát hiện, độ nhạy kỹ thuật realtime RT-PCR, nghiên cứu sử dụng mẫu RNA chứng dương pha loãng từ 105÷100 copies/µl. Mồi và probe được thiết kế dựa trên trình tự tham chiếu trên ngân hàng gen. Độ đặc hiệu của phương pháp được đánh giá dựa trên khả năng không bắt chéo với các virus khác. Một phản ứng khuếch đại nội chuẩn để đánh giá hiệu quả tách chiết và hiệu suất khuếch đại của phản ứng realtime RT-PCR. Kết quả: Ngưỡng phát hiện ZIKV và CHIKV tương ứng 5 và 3 copies/µl tương đương 500 và 300 copies/ml. Độ nhạy và độ đặc hiệu tương ứng 95%, 100%. Kết luận: Đã thiết lập thành công quy trình realtime RT-PCR phát hiện virus Zika và Chikungunya với độ nhạy, độ đặc hiệu kỹ thuật cao.
#realtime RT-PCR #Zika virus #Chikungunya virus
ĐÁNH GIÁ SỰ ĐỒNG NHẤT VỀ KẾT QUẢ REALTIME RT-PCR TRÊN HỆ THỐNG XÉT NGHIỆM COBAS 6800 SO VỚI QUY TRÌNH CỦA WHO TRONG CHẨN ĐOÁN XÁC ĐỊNH SARS-CoV-2
Hiệu quả chẩn đoán trên lâm sàng của các phương pháp xét nghiệm PCR chẩn đoán SARS-CoV-2 đóng vai trò rất quan trọng trong công tác xác định ca bệnh, theo dõi điều trị cũng như dự báo quy mô diễn biến dịch. Chúng tôi thực hiện nghiên cứu này nhằm đánh giá sự đồng nhất về kết quả xét nghiệm Realtime RTPCR thực hiện trên hệ thống COBAS 6800 so với quy trình được Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) khuyến cáo trên 309 mẫu bệnh phẩm dịch tỵ hầu của người bệnh trong thời gian từ 2020 đến 2022 tại Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương. Kết quả cho thấy, hệ thống COBAS 6800 phát hiện được nhiều mẫu dương tính hơn so với khi làm theo quy trình WHO, trong đó số mẫu cho kết quả dương tính khi thực hiện quy trình WHO là 232/309 (chiếm 75%), và trên Cobas 6800 là 281/309 (91%). Hệ số Kappa phản ánh mức độ tương đồng giữa hai phương pháp xét nghiệm bằng 0,43 tương ứng với mức độ phù hợp trung bình. Mức độ chênh lệch trung bình giữa giá trị Ct của gen E theo quy trình WHO so với giá trị Ct của gene ORF và gen E trên COBAS 6800 lần lượt là 3,18 và 2,38 cho thấy khả năng phát hiện vi rút theo hệ thống COBAS 6800 cao hơn gấp 10 lần. Do vậy, khi cần đáp ứng khẩn cấp dịch bệnh do SARS-CoV-2 gây ra, phòng xét nghiệm nên đưa vào sử dụng hệ thống xét nghiệm tự động có độ nhạy tốt hơn để có thể sàng lọc số lượng mẫu lớn.
#COVID-19 #Cobas 6800 #SARS-CoV-2
Development of a realtime RT-PCR assay for the rapid detection of influenza A(H2) viruses
Molecular and Cellular Probes - Tập 35 - Trang 57-63 - 2017
Tổng số: 13
- 1
- 2