Hybridoma là gì? Các bài báo nghiên cứu khoa học liên quan

Hybridoma là tế bào lai giữa lympho B sản xuất kháng thể đặc hiệu và tế bào myeloma bất tử, kết hợp khả năng sinh sản vô hạn với năng lực tổng hợp kháng thể đơn dòng chuẩn xác. Tế bào hybridoma duy trì gene sản xuất kháng thể và khả năng phân chia liên tục, cho phép tạo kháng thể đơn dòng có độ đặc hiệu cao và độ thuần nhất ổn định trong chẩn đoán, nghiên cứu và điều trị.

Giới thiệu về Hybridoma

Hybridoma là tế bào lai giữa lympho B sản xuất kháng thể đặc hiệu và tế bào myeloma bất tử, kết hợp khả năng sinh sản vô hạn với năng lực tổng hợp kháng thể đơn dòng. Phương pháp này do Köhler và Milstein phát triển năm 1975, cách mạng hóa công nghệ sinh học bằng việc tạo ra kháng thể đơn dòng có độ thuần nhất cao và khả năng sản xuất đại trà (Köhler & Milstein, 1975).

Các hybridoma giữ nguyên cấu trúc gene mã hóa vùng biến đổi (variable) và vùng hằng định (constant) của kháng thể, đảm bảo sản xuất kháng thể với cùng độ ái lực và đặc hiệu. Chu trình nuôi cấy liên tục cho phép thu lượng kháng thể ổn định, phù hợp ứng dụng trong chẩn đoán, nghiên cứu và điều trị.

Công nghệ hybridoma đã mở ra kỷ nguyên kháng thể đơn dòng, phục vụ chẩn đoán bằng ELISA, miễn dịch huỳnh quang, flow cytometry và liệu pháp ung thư (trastuzumab, rituximab). Ưu điểm lớn nhất là khả năng kiểm soát tính đặc hiệu, giảm nhiễm lẫn và tăng độ nhạy trong phát hiện kháng nguyên mục tiêu.

Nguyên lý công nghệ Hybridoma

Quy trình tạo hybridoma bắt đầu bằng miễn dịch động vật (chuột, chuột mũi trắng) với kháng nguyên tinh khiết hoặc tái tổ hợp, kích thích lympho B sinh ra kháng thể đặc hiệu. Sau mỗi đợt tiêm chủng, tế bào lympho B được thu thập từ lách hoặc hệ bạch huyết.

Lympho B sau khi tách được ghép với tế bào myeloma (dòng thiếu enzyme HGPRT) trong môi trường chứa PEG (polyethylene glycol) hoặc qua kỹ thuật electrofusion. Mỗi tế bào lai thành công sẽ mang cả gene sống sót của myeloma và gene tổng hợp kháng thể của lympho B, cho phép nuôi cấy kéo dài đồng thời sản xuất kháng thể đặc hiệu.

  • Miễn dịch ban đầu: Tiêm kháng nguyên 2–3 lần, mỗi lần cách nhau 2–3 tuần.
  • Tách lympho B: Mổ lách để thu tế bào B giàu kháng thể.
  • Ghép tế bào: PEG hoặc electrofusion nối màng tế bào B và myeloma.
  • Nuôi trong HAT: Chỉ hybridoma sống sót, loại trừ tế bào không ghép đúng.

Phương pháp ghép tế bào

Phương pháp PEG sử dụng polyethylene glycol nồng độ 30–50% để hòa màng tế bào tạm thời, tạo điều kiện cho tế bào B và myeloma liên kết. PEG kích thích màng mềm dẻo nhưng có thể gây độc tế bào nếu thời gian xử lý quá lâu hoặc nồng độ quá cao.

Công nghệ electrofusion áp dụng dòng điện xung (1–2 kV/cm, tần số 10–100 kHz) để hình thành lỗ tạm thời trên màng tế bào, tạo kênh nối màng mà ít tổn thương hơn PEG. Sau đó, tế bào ghép được nuôi trong môi trường HAT chọn lọc để loại bỏ tế bào không lai tạo.

Phương phápNguyên lýƯu điểmHạn chế
PEG Hòa màng với polyethylene glycol Đơn giản, chi phí thấp Độc với tế bào, hiệu suất thấp (~10%)
Electrofusion Dòng điện xung tạo kênh nối màng Hiệu suất cao (~30–50%), ít tổn thương Cần thiết bị chuyên dụng, tối ưu thông số

Hiệu suất ghép và độ sống sót ban đầu của hybridoma quyết định số clone có thể chọn lọc. Việc tối ưu pha xử lý PEG hoặc xung điện, thời gian phục hồi và tỉ lệ tế bào B/myeloma là yếu tố then chốt nâng cao tỷ lệ thành công.

Chọn lọc và sàng lọc Hybridoma

Sau ghép, hỗn hợp tế bào được nuôi trong môi trường HAT để chỉ hybridoma sinh trưởng (myeloma thiếu HGPRT không sống, lympho B không phân chia lâu). Sau 7–10 ngày, các ổ tế bào biểu hiện kháng thể bắt đầu tiết kháng thể vào môi trường.

Giá trị đặc hiệu của kháng thể được đánh giá qua ELISA, Western blot hoặc flow cytometry. Ổ nào cho tín hiệu mạnh và đặc hiệu sẽ được chọn để pha loãng giới hạn (limiting dilution) tạo clones đơn dòng, đảm bảo mỗi dòng xuất phát từ một tế bào lai duy nhất.

  • Môi trường HAT: Hypoxanthine–aminopterin–thymidine chọn lọc hybrid.
  • ELISA kiểm tra: Định tính và định lượng kháng thể tiết ra.
  • Limiting dilution: Hạn chế tế bào xuống 0.5–1 tế bào/well để thu clone đơn dòng.
  • Kiểm tra lại: Đánh giá lại kháng thể sau 2–3 lần nhân nuôi.

Clone đạt yêu cầu được lưu trữ dài hạn trong nitơ lỏng và mở rộng nuôi cấy cho sản xuất kháng thể hoặc nghiên cứu tiếp theo. Quy trình chuẩn hóa và kiểm soát chất lượng qua nhiều thế hệ nuôi là yếu tố quyết định độ ổn định và tính đồng nhất của kháng thể đơn dòng.

Sản xuất kháng thể đơn dòng

Các dòng hybridoma đã sàng lọc được mở rộng nuôi cấy in vitro trong bình cell culture với môi trường chứa dưỡng chất như RPMI 1640 bổ sung FBS 10–20% và các yếu tố tăng trưởng. Mật độ tế bào thường dao động 0,5–1 triệu tế bào/mL, nuôi cấy lắc nhẹ 37 °C và 5% CO₂ để đảm bảo ôxy và chất dinh dưỡng phân phối đồng đều. Kháng thể đơn dòng tiết vào môi trường nuôi sẽ được thu hồi qua ly tâm loại tế bào rồi xử lý tiếp.

Phương pháp thu hồi kháng thể in vitro phổ biến gồm:

  • Đông kết muối (Ammonium sulfate precipitation): Tách kháng thể khỏi protein nền bằng cách điều chỉnh độ muối.
  • Cột lọc Protein A/G: Áp dụng tính tương tác cao giữa Fc region và Protein A/G để tinh sạch kháng thể.
  • Cô đặc bằng siêu lọc: Sử dụng màng lọc có kích thước lỗ 30–100 kDa để loại bỏ tạp chất thấp phân tử và cô đặc kháng thể.

Ở quy mô lớn, hybridoma cũng có thể nuôi cấy trong máy lên men (bioreactor) cho phép kiểm soát pH, pO₂ và đánh giá hiệu suất tiết kháng thể liên tục. Việc duy trì mật độ tế bào ổn định và thu kháng thể liên tục giúp tăng năng suất và giảm chi phí sản xuất.

Đặc tính và định tính kháng thể

Kháng thể đơn dòng thu được cần được phân tích về độ tinh khiết, đặc hiệu và ái lực (affinity). Độ tinh khiết thường được đánh giá bằng SDS-PAGE và sắc ký size-exclusion chromatography (SEC) để xác định tỷ lệ kháng thể nguyên vẹn và phân tách khỏi các mảnh vỡ.

Đặc hiệu kháng nguyên và ái lực được đo bằng:

  • ELISA định tính/định lượng: Kiểm tra sự tương tác kháng nguyên–kháng thể qua tín hiệu màu hoặc huỳnh quang.
  • Surface Plasmon Resonance (SPR): Phân tích động học gắn kết (kₐ và k_d) và tính toán hằng số cân bằng (KD).
  • Biolayer Interferometry (BLI): Đo tương tác thời gian thực và xác định thông số liên kết.

Các bước kiểm định này đảm bảo kháng thể thu được có tính ổn định, độ ái lực cao (KD thường <10−9 M) và không phản ứng chéo với kháng nguyên tương tự, phù hợp cho ứng dụng chẩn đoán hoặc trị liệu.

Ứng dụng của Hybridoma

Hybridoma cho phép tạo kháng thể đơn dòng với tính đặc hiệu cao, phục vụ đa dạng trong y sinh và công nghiệp. Trong chẩn đoán lâm sàng, kháng thể đơn dòng ứng dụng trong:

  • ELISA: Phát hiện kháng nguyên/kháng thể của vi sinh vật (HIV, HBV) hoặc marker ung thư (PSA, CA 125).
  • Immunohistochemistry (IHC): Nhuộm mô paraffin để xác định sự biểu hiện protein trong tế bào mô bệnh lý (Abcam IHC Protocol).
  • Flow Cytometry: Định lượng tế bào mang biểu hiện kháng nguyên bề mặt, đánh giá tỉ lệ lympho T/B và phân nhóm tế bào (ThermoFisher Flow Cytometry).

Trong điều trị, kháng thể đơn dòng đóng vai trò trong liệu pháp ung thư (trastuzumab chống HER2, rituximab chống CD20), liệu pháp miễn dịch tự động (infliximab, adalimumab) và điều trị nhiễm trùng. Chức năng trung hòa kháng nguyên và kích hoạt miễn dịch tế bào giúp cải thiện tiên lượng bệnh nhân.

Ưu điểm và hạn chế của công nghệ Hybridoma

Ưu điểm nổi bật là khả năng sản xuất kháng thể đơn dòng có độ thuần nhất và đặc hiệu cao, tái sản xuất vô hạn từ một clone duy nhất. Hybridoma cũng cho phép tạo kháng thể với nhiều isotype khác nhau (IgG1, IgG2a, IgM), phù hợp với mục đích nghiên cứu hoặc trị liệu.

Hạn chế bao gồm thời gian tạo clone dài (6–8 tuần), nguy cơ mất dần khả năng tiết kháng thể sau nhiều thế hệ nuôi cấy, và giới hạn chủng loài (mouse, rat) có thể gây phản ứng miễn dịch khi sử dụng ở người. Phương pháp ascites giúp thu lượng cao nhưng gây đau và viêm phúc mạc cho động vật (NCBI PMC5306422).

Tiến bộ và hướng phát triển

Công nghệ humanized hybridoma sử dụng kết hợp gene chuột và gene người để tạo kháng thể bán tổng hợp, giảm phản ứng miễn dịch khi điều trị ở người. Phage display và yeast display cho phép sàng lọc thư viện liên kết domain (scFv, Fab) nhanh chóng với ái lực cao.

Ứng dụng CRISPR/Cas9 giúp chỉnh sửa trực tiếp dòng hybridoma để tối ưu hóa biểu hiện chuỗi nặng và chuỗi nhẹ, điều chỉnh glycosylation hoặc chèn marker báo hiệu, nâng cao chất lượng và chức năng kháng thể. Các dòng tế bào tái tổ hợp (CHO, HEK293) đang được phát triển song song để mở rộng khả năng sản xuất kháng thể tái tổ hợp.

Tài liệu tham khảo

  • Köhler, G., & Milstein, C. (1975). Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature, 256(5517), 495–497. doi:10.1038/256495a0
  • Mahoney, M. J., et al. (2001). Electrofusion of mammalian cells. Analytical Biochemistry, 294(2), 185–191. doi:10.1016/S0003-2697(01)00540-6
  • Stollar, B. D., & Morris, L. (2000). Monoclonal Antibodies. Academic Press.
  • Chames, P., Van Regenmortel, M., Weiss, E., & Baty, D. (2009). Therapeutic antibodies: successes, limitations and hopes for the future. British Journal of Pharmacology, 157(2), 220–233. doi:10.1111/j.1476-5381.2009.00190.x
  • Ho, M., Nagata, S., & Pastan, I. (2006). Isolation of anti-CD22 Fv with high affinity by Fv display on human cells. Proceedings of the National Academy of Sciences, 103(25), 9637–9642. doi:10.1073/pnas.0602576103

Các bài báo, nghiên cứu, công bố khoa học về chủ đề hybridoma:

Sự sản xuất yếu tố tăng trưởng hybriodoma bởi bạch cầu đơn nhân người Dịch bởi AI
European Journal of Immunology - Tập 17 Số 10 - Trang 1411-1416 - 1987
Tóm tắtBạch cầu đơn nhân của con người sản xuất một yếu tố tăng trưởng (HGF) cho các tế bào hybridoma và plasmacytoma. Gần đây, HGF đã được chứng minh là giống với IFN-β2, protein 26 kDa và BSF-2. HGF có thể được định lượng trong một thử nghiệm sự tăng trưởng với dòng tế bào hybridoma phụ thuộc HGF B13.29. Bằng cách chọn lọc một biến thể cực kỳ nhạy cảm của dòng tế...... hiện toàn bộ
#HGF #yếu tố tăng trưởng #tế bào hybridoma #bạch cầu đơn nhân #sự sản xuất tế bào
Role for c-myc in Activation-Induced Apoptotic Cell Death in T Cell Hybridomas
American Association for the Advancement of Science (AAAS) - Tập 257 Số 5067 - Trang 212-214 - 1992
Immature T cells and some T cell hybridomas undergo apoptotic cell death when activated through the T cell receptor complex, a phenomenon that is probably related to antigen induced negative selection of developing T cells. This activation-induced apoptosis depends on active protein and RNA synthesis in the dying cells, although none of the genes required for this process have...... hiện toàn bộ
A kinetic analysis of hybridoma growth and metabolism in batch and continuous suspension culture: Effect of nutrient concentration, dilution rate, and pH
Biotechnology and Bioengineering - Tập 32 Số 8 - Trang 947-965 - 1988
AbstractHybridomas are finding increased use for the production of a wide variety of monoclonal antibodies. Understanding the roles of physiological and environmental factors on the growth and metabolism of mammalian cells is a prerequisite for the development of rational scale‐up procedures. An SP2/0‐derived mouse hybridoma has been employed in the present work as...... hiện toàn bộ
Antigenic structure of influenza virus haemagglutinin defined by hybridoma antibodies
Nature - Tập 290 Số 5808 - Trang 713-717 - 1981
Isolation of functional human coagulation factor V by using a hybridoma antibody.
Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America - Tập 78 Số 1 - Trang 162-166 - 1981
Spleen cells obtained from mice immunized with partially purified human coagulation Factor V were fused with NS-1 mouse myeloma cells, and hybrids were selected. Culture media were screened for anti-Factor V activity, and an antibody-positive clone was obtained and passaged as an ascites tumor in mice. The ascitic fluid from the hybridoma-bearing mouse could be diluted 1:10(6) before losin...... hiện toàn bộ
Activation-induced cell death in T cell hybridomas is due to apoptosis. Morphologic aspects and DNA fragmentation.
Journal of Immunology - Tập 144 Số 9 - Trang 3326-3333 - 1990
Abstract Some T cell hybridomas, upon activation via the TCR, rapidly undergo cell death. In this paper, we demonstrate that this activation-induced cell death (AICD) is accompanied by morphologic changes seen at the electron and light microscopy levels. The most striking changes are an extensive condensation of the chromatin and formation of membran...... hiện toàn bộ
Shear sensitivity of cultured hybridoma cells (CRL-8018) depends on mode of growth, culture age and metabolite concentration
Journal of Biotechnology - Tập 7 - Trang 229-246 - 1988
Bcl-2 blocks glucocorticoid- but not Fas- or activation-induced apoptosis in a T cell hybridoma.
Journal of Immunology - Tập 155 Số 10 - Trang 4644-4652 - 1995
Abstract Overexpression of Bcl-2 can prevent or markedly delay cell death induced by a variety of apoptotic stimuli. Although Fas and Fas ligand (FasL) interactions play a major role in the elimination of self-reactive T cells in the periphery, inhibition of Fas-mediated killing by Bcl-2 has not been consistently observed. The mouse T hybridoma 2B4.1...... hiện toàn bộ
Antigen-dependent stimulation by bone marrow-derived mast cells of MHC class II-restricted T cell hybridoma.
Journal of Immunology - Tập 151 Số 11 - Trang 6318-6328 - 1993
Abstract This paper describes a new role for mast cells as being able to present Ag to immune T cells. A mouse bone marrow-derived mast cell population obtained after 3 wk of culture in a conditioned medium has been shown to express a variety of membrane-associated Ag, including MHC class II and class I Ag, CD23, CD32, high affinity receptor for IgE,...... hiện toàn bộ
Generation of hybridomas secreting murine reaginic antibodies of anti-DNP specificity.
Journal of Immunology - Tập 124 Số 2 - Trang 775-780 - 1980
Abstract High frequency of hybridoma lines secreting large amounts of reaginic anti-DNP antibodies were generated by the fusion of splenic lymphocytes enriched by adoptive transfer of immune cells and the NSI plasmacytoma cell line. The murine IgE molecule binds DNP with high affinity and was specifically purified by immunoabsorption. The 190,000 dal...... hiện toàn bộ
Tổng số: 759   
  • 1
  • 2
  • 3
  • 4
  • 5
  • 6
  • 10

Chủ đề khác

#thử nghiệm kéo

Thử nghiệm kéo là gì? Các bài nghiên cứu khoa học liên quan

#chức năng tâm thu

Chức năng tâm thu là gì? Các nghiên cứu khoa học liên quan

#bất bình đẳng không gian

Bất bình đẳng không gian là gì? Các bài nghiên cứu khoa học

#thuốc kháng retrovirus

Thuốc kháng retrovirus là gì? Nghiên cứu khoa học liên quan

#u lympho

U lympho là gì? Các bài báo nghiên cứu khoa học liên quan

#ki 67

Ki 67 là gì? Các bài báo nghiên cứu khoa học liên quan

#risperidone

Risperidone là gì? Các bài nghiên cứu khoa học liên quan

#điều chỉnh thẩm thấu

Điều chỉnh thẩm thấu là gì? Các bài báo nghiên cứu khoa học

#exergy

Exergy là gì? Các bài báo nghiên cứu khoa học liên quan

#cấu trúc hoạt tính

Cấu trúc hoạt tính là gì? Các nghiên cứu khoa học liên quan


Xem thêm