American Journal of Physiology - Cell Physiology

Orexin A và orexin B là các peptide ở vùng dưới đồi hoạt động trên các đích của chúng thông qua hai thụ thể kết hợp với protein G (thụ thể OX₁ và OX₂). Trong hệ thống thần kinh trung ương, các thân tế bào sản xuất orexin được định vị trong một vùng hẹp trong vùng dưới đồi bên và chiếu tới chủ yếu các vùng liên quan đến việc ăn uống, giấc ngủ và các chức năng tự động. Thông qua các tác động giả định trước và sau synapse, orexin làm tăng hoạt động synaptic trong các vùng này. Trong các tế bào thần kinh và tế bào biểu hiện thụ thể tái tổ hợp, orexin gây ra sự gia tăng Ca²⁺, điều này chủ yếu phụ thuộc vào sự thâm nhập. Hoạt động của các tế bào orexinergic dường như được kiểm soát bởi các tín hiệu liên quan đến ăn uống và giấc ngủ thông qua nhiều loại neurotransmitter/hormone từ não và các mô khác. Orexin và thụ thể orexin cũng được tìm thấy bên ngoài hệ thần kinh trung ương, đặc biệt là ở các cơ quan liên quan đến việc ăn uống và sinh tổng hợp năng lượng, ví dụ, đường tiêu hóa, tuyến tụy và tuyến thượng thận. Trong bài đánh giá hiện tại, chúng tôi tập trung vào các đặc tính sinh lý của các tế bào tiết ra hoặc đáp ứng với orexin.

Ảnh hưởng của tình trạng động kinh do bicuculline gây ra (SE) lên tỷ lệ chuyển hóa glucose tại chỗ trong não (LCMRglc) đã được nghiên cứu trên những con khỉ marmoset được gây mê bằng ketamine ở tuổi 2 tuần, sử dụng kỹ thuật autoradiography 2-[14C]-deoxy-D-glucose. Để ước lượng LCMRglc trong vỏ não và đồi thị trong giai đoạn SE, hằng số gom nhóm (LC) đối với 2-deoxy-D-glucose (2-DG) và các hằng số tỷ lệ cho 2-DG và glucose đã được tính toán cho các vùng này. Giá trị LC kiểm soát là 0.43 trong vỏ não trán-parietal, 0.51 trong vỏ não thái dương, và 0.50 trong đồi thị; nó đã tăng lên 1.07 trong vỏ não trán-parietal, 1.13 trong vỏ não thái dương, và 1.25 trong đồi thị sau 30 phút cơn động kinh. Với các giá trị LC kiểm soát, LCMRglc trong vỏ não trán-parietal, vỏ não thái dương, và đồi thị vùng lưng giữa có vẻ như tăng gấp bốn đến sáu lần. Với các giá trị LC trong cơn động kinh, LCMRglc tăng từ 1.5 đến 2 lần và chỉ trong vỏ não. Trong thời gian cơn động kinh kéo dài 45 phút, LCMRglc trong vỏ não và đồi thị có khả năng tăng từ 4 đến 6 lần ban đầu và sau đó giảm xuống mức 1.5 đến 2 lần khi nồng độ glucose trong mô giảm. Kết hợp với các kết quả trước đây của chúng tôi cho thấy sự cạn kiệt các phosphat năng lượng cao và glucose trong những vùng này, dữ liệu cho thấy rằng nhu cầu năng lượng vượt quá nguồn cung glucose. Các ảnh hưởng lâu dài của những thay đổi chuyển hóa này lên não đang phát triển vẫn chưa được xác định.

Đường tín hiệu calcineurin/yếu tố hạt nhân của tế bào T được kích hoạt (NFAT) đã được phát hiện có vai trò trong việc điều chỉnh tăng trưởng và biệt hóa ở một số loại tế bào. Tuy nhiên, ý nghĩa chức năng của NFAT trong hệ mạch vẫn còn chưa rõ ràng. Trong nghiên cứu này, chúng tôi cho thấy NFATc1, NFATc3 và NFATc4 được biểu hiện trong các động mạch cơ trơn tử cung của người. Phân tích miễn dịch huỳnh quang kính hiển vi đồng phát và phân tích Western blot cho thấy endothelin-1 hiệu quả làm tăng sự tích lũy hạt nhân của NFATc3 trong các động mạch tự nhiên. Endothelin-1 cũng kích thích hoạt động phiên mã phụ thuộc NFAT, như được thể hiện bởi thử nghiệm báo cáo luciferase. Cả sự tích lũy hạt nhân của NFAT do chất chủ vận kích thích và hoạt động phiên mã đều bị ngăn chặn bởi chất ức chế calcineurin CsA và chất ức chế NFAT mới A-285222. Việc ức chế NFAT kéo dài đã làm giảm đáng kể sản xuất IL-6 trong các động mạch cơ trơn tử cung nguyên vẹn và ức chế quá trình tăng sinh tế bào trong các tế bào cơ trơn mạch được nuôi cấy từ các mẫu lấy từ cùng một động mạch. Hơn nữa, bằng cách sử dụng RNA can thiệp nhỏ để giảm NFATc3, chúng tôi cho thấy isoform này tham gia vào việc điều chỉnh quá trình tăng sinh tế bào. Quá trình tổng hợp protein trong các động mạch nguyên vẹn được điều tra bằng cách sử dụng autoradiography của sự kết hợp [³⁵S]methionine trong môi trường nuôi cấy không có huyết thanh. Việc ức chế tín hiệu NFAT không ảnh hưởng đến tổng hợp protein chung hoặc cụ thể là tỷ lệ tổng hợp các protein chính liên quan đến hệ thống co bóp/xương. Một kiểu hình co bóp nguyên vẹn dưới các điều kiện này cũng được thể hiện bởi phản ứng lực không thay đổi khi bị khử cực hoặc kích thích bởi chất chủ vận. Kết quả của chúng tôi chứng minh sự biểu hiện và hoạt hóa NFAT trong các mạch máu của người và chỉ ra A-285222 như một chất ức chế dược lý mạnh mẽ của tín hiệu NFAT trong hệ mạch.

Trong quá trình thu hút các tế bào cơ trơn mạch máu (VSMCs) đến các mầm mới hình thành nhờ yếu tố tăng trưởng do tiểu cầu (PDGF)-BB, các tế bào VSMCs này chuyển từ kiểu hình co bóp sang kiểu hình di động. Điều này liên quan đến việc giảm biểu hiện các dấu hiệu co bóp như α-actin cơ trơn (SM) và tăng cường biểu hiện các gen thúc đẩy di động như metalloproteinase-2 (MMP-2). Sự điều chỉnh MMP-2 trong phản ứng với PDGF-BB là phức tạp và liên quan đến cả các con đường tín hiệu kích thích và ức chế, dẫn đến sự chậm trễ đáng kể trong việc tăng cường biểu hiện. Ở đây, chúng tôi cung cấp bằng chứng cho thấy sự chậm trễ trong việc tăng cường MMP-2 có thể là do sự biểu hiện và kích hoạt tự tiết của yếu tố tăng trưởng chuyển dạng (TGF)-β, vốn được biết đến là tác nhân thúc đẩy kiểu hình co bóp ở các tế bào VSMCs. Trong khi PDGF-BB có thể gây ra sự mất đi các sợi căng và tiếp xúc điểm, TGF-β có khả năng chặn hoặc đảo ngược sự chuyển tiếp này tới trạng thái không co bóp. Tuy nhiên, TGF-β không ức chế các sự kiện tín hiệu sớm bị kích thích bởi PDGF-BB. Qua thời gian, mặc dù PDGF-BB kích thích tăng nồng độ TGF-β1, nó lại ức chế sự biểu hiện của TGF-β2 và TGF-β3, dẫn đến sự giảm tổng thể trong lượng TGF-β, qua đó thúc đẩy việc tăng cường MMP-2. Những phát hiện này cho thấy rằng sự biểu hiện MMP-2 bị ức chế bởi một ngưỡng nồng độ TGF-β hoạt động, điều này lần lượt thúc đẩy một kiểu hình VSMC co bóp mà ngăn ngừa quá trình tăng cường MMP-2.

Các tương tác keo giữa tế bào đơn nhân với tế bào cơ trơn mạch máu (VSMC) có thể góp phần vào sự giữ lại tế bào đơn nhân-đại thực bào dưới nội mạc trong bệnh xơ vữa động mạch. Chúng tôi đã điều tra tác động của angiotensin II (ANG II) và yếu tố tăng trưởng xuất phát từ tiểu cầu (PDGF)-BB đến các tương tác giữa VSMC và tế bào đơn nhân. Việc điều trị tế bào VSMC động mạch chủ người (HVSMC) bằng ANG II hoặc PDGF-BB đã làm tăng đáng kể sự gắn kết với tế bào đơn nhân THP-1 người và với các tế bào đơn nhân trong máu ngoại vi. Điều này đã bị ức chế bởi các kháng thể đối với các integrin β₁ và β₂ của tế bào đơn nhân. Sự gắn kết cũng giảm đi khi quá trình trao đổi chất axit arachidonic (AA) của VSMC bị chặn bởi các chất ức chế 12/15-lipoxygenase (12/15-LO) hoặc cyclooxygenase-2 (COX-2). Ngược lại, sự gắn kết đã được tăng cường bởi sự biểu hiện quá mức của 12/15-LO hoặc COX-2. Việc điều trị trực tiếp HVSMC bằng AA hoặc các sản phẩm chuyển hóa của nó cũng làm tăng sự gắn kết. Hơn nữa, VSMC lấy từ chuột knockout 12/15-LO thể hiện sự gắn kết giảm với các tế bào đơn nhân của chuột so với chuột kiểm soát di truyền. Sử dụng các chất ức chế truyền tín hiệu đặc hiệu, chúng tôi đã chứng minh sự tham gia của Src, phosphoinositide 3-kinase và MAPKs trong sự gắn kết do ANG II hoặc PDGF-BB gây ra. Thú vị thay, sau khi đồng văn hóa với HVSMC, sự biểu hiện bề mặt của thụ thể thu gom CD36 trên tế bào THP-1 đã tăng lên. Những kết quả này cho thấy lần đầu tiên rằng các yếu tố tăng trưởng có thể đóng vai trò bổ sung trong bệnh xơ vữa động mạch bằng cách tăng cường sự gắn kết của tế bào đơn nhân với VSMC thông qua quá trình trao đổi chất AA và các con đường tín hiệu quan trọng. Điều này có thể dẫn đến việc giữ lại tế bào đơn nhân dưới nội mạc, sự biểu hiện CD36 và sự hình thành tế bào bọt.

Ti thể gan chuột được chứng minh là có khả năng chuyển đổi các dạng este acetoxymethyl của fura-2 và indo-1 thành các dạng chỉ thị phụ thuộc vào Ca2+. Quang phổ kích thích của sản phẩm chuyển đổi phụ thuộc Ca2+ của este acetoxymethyl fura-2 cho thấy nó tương tự như dạng axit pentacarboxylic của fura-2. Một cuộc điều tra hệ thống về các phụ thuộc của độ mạnh ion và pH của phát quang các dạng axit pentacarboxylic của những chỉ thị này cho thấy có những thay đổi nhỏ trong các khoảng được cho là xảy ra trong môi trường ty thể sau khi hấp thụ Ca2+. Mức độ Ca2+ tự do trong ti thể được nghiên cứu cả trước và sau khi Ca2+ được giữ lại bởi ti thể, và một ước lượng sơ bộ được đưa ra về sự đóng góp của ti thể vào phát quang fura-2 phụ thuộc Ca2+ của một huyền phù tế bào gan.

Nghiên cứu này được tiến hành nhằm xác định ảnh hưởng của hiện tượng mất màu (photobleaching) đến các tính chất quang phổ của thuốc nhuộm huỳnh quang nhạy cảm với canxi fura-2. Fura-2, dù ở trong tế bào hay trong các dung dịch hiệu chuẩn, đều bị mất màu khi tiếp xúc với ánh sáng kích thích. Khác với niềm tin phổ biến, hiện tượng mất màu đã làm thay đổi các tính chất quang phổ của thuốc nhuộm. Sự phân hủy của quang phổ kích thích từ các dung dịch fura-2 bị mất màu một phần đã tiết lộ một hợp chất trung gian vẫn giữ được tính huỳnh quang và không nhạy cảm với canxi trong cùng một phạm vi như fura-2, nhưng có khả năng gắn kết canxi ở nồng độ milimolar. Sự hiện diện của hợp chất trung gian này vi phạm một trong những giả định mà phương pháp tỷ lệ chuẩn hóa dựa vào; tức là, các loài huỳnh quang duy nhất hiện hữu là dạng gắn canxi và dạng anion tự do của fura-2. Do vậy, nếu hiện tượng mất màu xảy ra, phương pháp tỷ lệ sẽ không cung cấp được giá trị nồng độ canxi chính xác. Chúng tôi tính toán rằng chỉ cần mất 8% tổng cường độ huỳnh quang là đủ để tạo ra một lỗi lớn. Hiện tượng mất màu của các tế bào gắn fura-2 và các dung dịch hiệu chuẩn có chứa fura-2 có thể được giảm thiểu bằng cách giảm nồng độ oxy và giảm cường độ ánh sáng kích thích. Các chiến lược được trình bày nhằm giữ cho tỷ lệ tín hiệu trên tiếng ồn cao trong các hệ thống phát hiện huỳnh quang fura-2, mặc dù cường độ kích thích thấp hơn, để hiện tượng mất màu và sự sai lệch trong việc tính toán [Ca2+] có thể được hạn chế đến mức tối đa.

Dye nhạy cảm với canxi và có độ huỳnh quang cao mới, fura-2, có thể được tải vào các tế bào nguyên vẹn một cách không phá hủy thông qua este thấm qua màng của nó và được sử dụng để đo nồng độ ion canxi tự do trong từng tế bào. Để fura-2 có thể tín hiệu canxi trong tế bào chất, nó phải được phân bố đồng đều và độc quyền trong không gian tế bào chất. Tuy nhiên, kiểm tra vi mô đối với các tế bào nội mô động mạch chủ bò được tải fura-2 qua việc tiếp xúc với este thấm qua màng cho thấy huỳnh quang liên quan đến các cấu trúc nội bào tách biệt, thay vì sự phân bố đồng nhất như mong đợi của một thuốc nhuộm tế bào chất. Việc đánh dấu đồng thời các tế bào nội mô động mạch chủ bò bằng fura-2 và rhodamine 123 (thuốc nhuộm huỳnh quang quan trọng cho ti thể) xác định các cấu trúc này là ti thể. Không có sự phân bố thuốc nhuộm tế bào con nào được quan sát khi các tế bào được tải bằng các thuốc nhuộm có khả năng tạo ra tế bào chất khác mà tiếp cận tế bào chất thông qua este thấm qua màng. Cả carboxyfluorescein và indo-1 (một thành viên khác trong gia đình chỉ báo canxi thế hệ thứ hai) đều nhuộm tế bào chất một cách khuếch tán. Đề xuất rằng huỳnh quang fura-2 tích tụ trong một số tế bào liên kết với ti thể. Việc đánh giá phân bố nội bào của fura-2 là quan trọng khi chỉ báo này được sử dụng để đo nồng độ ion canxi tự do trong tế bào chất.

Các tế bào glioma C6 chuột đã được thích nghi với môi trường ưu trương trong thời gian dài tích lũy lượng lớn inositol. Khi được trở lại điều kiện đẳng trương, các tế bào phồng lên và mất inositol một cách chậm rãi thông qua sự gia tăng từ bốn đến năm lần trong tốc độ mất inositol thụ động. Con đường mất inositol là một cơ chế vận chuyển độc lập với Na(+) có ái lực thấp đối với inositol và bị ức chế bởi quinidine, quinine, các chất ức chế vận chuyển anion khác nhau, và các axit béo cis không bão hòa. Việc nâng cao Ca2+ (Ca2+i) trong tế bào do ionomycin kích thích không có tác động đến mức mất inositol cơ bản hoặc do sự phồng lên gây ra. Mất inositol không bị ức chế bởi việc chelat hóa Ca2+i bằng 1,2-bis(2-aminophenoxy)-ethane-N,N,N',N'-tetraacetic acid. Thêm vào đó, mức Ca2+i đo được bằng fura 2 không thay đổi trong quá trình tế bào phồng lên, cho thấy sự gia tăng Ca2+i không điều chỉnh mất inositol. Việc tiếp xúc các tế bào C6 với 20 nM phorbol 12-myristate 13-acetate, 0.5 mM adenosine 3',5'-cyclic monophosphate (cAMP), hoặc 50 microM forskolin không có tác động đến mức mất inositol cơ bản nhưng kích thích sự giảm inositol do sự phồng lên lần lượt là 2.6-, 2.2-, và 3.4 lần. Tuy nhiên, việc tiếp xúc với các chất ức chế kinase protein 1-(5-isoquinolinylsulfonyl)-2-methylpiperazine hoặc staurosporine hoặc sự giảm hoạt tính protein kinase C (PKC) không có tác dụng ức chế mất inositol, và mức cAMP trong tế bào không thay đổi do sự phồng lên. Những kết quả này cho thấy rằng sự kích thích PKC và protein kinase A điều chỉnh hoạt động của con đường mất inositol nhưng không cần thiết cho sự kích hoạt do phồng lên. Ketoconazole, cinnamyl-3,4-dihydroxy-alpha-cyanocinnamate, và gossypol, các chất ức chế enzyme lipoxygenase, đã chặn cả việc mất inositol cơ bản và do sự phồng lên, gián tiếp gợi ý rằng các sản phẩm chuyển hóa từ lipoxygenase có thể chịu trách nhiệm cho việc kích hoạt cơ chế thoát ra do phồng lên. Các đặc điểm của việc mất inositol trong các tế bào C6 tương tự như những gì đã được mô tả cho việc thoát sorbitol và taurine điều chỉnh thể tích trong một số loại tế bào, gợi ý sự tồn tại của một cơ chế vận chuyển chung.

Chúng tôi vừa chỉ ra rằng việc ức chế histone deacetylase (HDAC) in vivo thúc đẩy sự tái tạo cơ tim nội sinh trong những trái tim bị nhồi máu (Zhang L et al. J Pharmacol Exp Ther 341: 285–293, 2012). Hơn nữa, quan sát của chúng tôi cho thấy rằng việc ức chế HDAC thúc đẩy quá trình sinh tạo tim, điều này liên quan đến sự giảm thiểu của HDAC4. Tuy nhiên, vẫn chưa rõ là việc ức chế cụ thể HDAC4 có điều chỉnh các tế bào gốc tim (CSCs) để hỗ trợ sửa chữa cơ tim và duy trì hiệu suất tim hay không. Các tế bào gốc CSCs c-kit⁺ đã được tách chiết từ trái tim chuột trưởng thành và được chuyển gen bằng HDAC4 siRNA để làm giảm HDAC4 của CSCs c-kit⁺. Việc chuyển gen HDAC4 siRNA đã gây ra sự giảm đáng kể mRNA và protein HDAC4 trong các tế bào gốc CSCs c-kit⁺. Nhồi máu cơ tim (MI) ở chuột đã được tạo ra để đánh giá tác động của việc ức chế HDAC4 ở CSCs c-kit⁺ đối với tái tạo cơ tim in vivo khi các tế bào được đưa vào trái tim bị MI. Việc cấy ghép CSCs c-kit⁺ đã được điều trị bằng HDAC4 siRNA vào trái tim bị MI đã cải thiện chức năng thất, giảm thiểu sự tái cấu trúc thất và thúc đẩy tái tạo từ CSC cũng như quá trình tạo mạch mới. Hơn nữa, các tế bào cơ tim Ki67 và BrdU dương tính với sự tăng sinh đã tăng lên ở trái tim bị MI nhận được CSCs c-kit⁺ điều trị bằng HDAC4 siRNA so với trái tim bị MI được ghép với CSCs c-kit⁺ điều trị bằng siRNA kiểm soát. Thêm vào đó, so với trái tim bị MI ghép với CSCs c-kit⁺ nhiễm adenovirus GFP kiểm soát, trái tim bị MI nhận CSCs c-kit⁺ nhiễm adenovirus HDAC4 cho thấy sự hồi phục chức năng tim giảm, tái tạo từ CSC và tạo mạch mới, điều này đi kèm với sự tái cấu trúc thất bất lợi và sự giảm Ki67 cũng như BrdU dương tính với sự tăng sinh của các tế bào cơ tim. Sự ức chế HDAC4 đã thúc đẩy các CSCs c-kit⁺ vào quá trình phân hóa thành cam kết dòng tim in vitro, trong khi sự biểu hiện quá mức HDAC4 lại làm giảm quá trình sinh tạo tim từ CSCs c-kit⁺. Các kết quả của chúng tôi cho thấy rằng việc ức chế HDAC4 thúc đẩy sự tái tạo tim từ CSC và cải thiện việc phục hồi chức năng tim.