Nội dung được dịch bởi AI, chỉ mang tính chất tham khảo
Định lượng mRNA trong các mẫu lưu trữ bằng cách sử dụng các đầu dò đa dạng, mã màu
Tóm tắt
Một công nghệ mới được phát triển dựa trên đầu dò, hệ thống định lượng gene NanoString nCounter™, đã cho thấy khả năng định lượng chính xác các bản sao mRNA bằng cách sử dụng một lượng nhỏ RNA tổng. Chúng tôi đã đánh giá khả năng của công nghệ này trong việc định lượng biểu hiện mRNA trong các mẫu ung thư miệng lưu trữ đã cố định trong formalin và nhúng paraffin (FFPE). Chúng tôi đã đo lường độ phong phú bản sao mRNA của 20 gen (COL3A1, COL4A1, COL5A1, COL5A2, CTHRC1, CXCL1, CXCL13, MMP1, P4HA2, PDPN, PLOD2, POSTN, SDHA, SERPINE1, SERPINE2, SERPINH1, THBS2, TNC, GAPDH, RPS18) trong 38 mẫu (19 mẫu ung thư miệng đông lạnh tươi và FFPE, được lưu trữ từ 1997-2008) bằng cả phương pháp NanoString và PCR có chuẩn bị SYBR Green I. Chúng tôi đã so sánh dữ liệu biểu hiện gen thu được thông qua NanoString với dữ liệu RQ-PCR trong cả mẫu đông lạnh tươi và FFPE. Các mẫu đông lạnh tươi cho thấy mối tương quan Pearson tổng thể tốt là 0.78, trong khi các mẫu FFPE cho thấy hệ số tương quan tổng thể thấp hơn là 0.59, có lẽ do chất lượng mẫu. Chúng tôi nhận thấy một hệ số tương quan cao hơn giữa các mẫu đông lạnh tươi và FFPE được phân tích bằng NanoString (r = 0.90) so với các mẫu áp dụng RQ-PCR (r = 0.50). Ngoài ra, dữ liệu từ NanoString cho thấy mối tương quan trung bình cao hơn (r = 0.94) giữa các cặp mẫu đông lạnh tươi và FFPE so với RQ-PCR (r = 0.53). Dựa trên kết quả của chúng tôi, chúng tôi kết luận rằng cả hai công nghệ đều hữu ích cho việc định lượng biểu hiện gene trong các mô tươi đông lạnh hoặc FFPE; tuy nhiên, phương pháp NanoString dựa trên đầu dò đạt được kết quả định lượng biểu hiện gene vượt trội hơn khi so với RQ-PCR trong các mẫu FFPE đã lưu trữ. Chúng tôi tin rằng kỹ thuật mới được phát triển này là tối ưu cho các nghiên cứu xác thực quy mô lớn sử dụng RNA tổng được tách ra từ các mẫu đã lưu trữ, FFPE.
Từ khóa
#NanoString #định lượng gene #mRNA #ung thư miệng #FFPE #PCR thời gian thực.Tài liệu tham khảo
von Ahlfen S, Missel A, Bendrat K, Schlumpberger M: Determinants of RNA quality from FFPE samples. PLoS One. 2007, 2 (12): e1261-10.1371/journal.pone.0001261.
Masuda N, Ohnishi T, Kawamoto S, Monden M, Okubo K: Analysis of chemical modification of RNA from formalin-fixed samples and optimization of molecular biology applications for such samples. Nucleic Acids Res. 1999, 27 (22): 4436-4443. 10.1093/nar/27.22.4436.
Bresters D, Schipper ME, Reesink HW, Boeser-Nunnink BD, Cuypers HT: The duration of fixation influences the yield of HCV cDNA-PCR products from formalin-fixed, paraffin-embedded liver tissue. J Virol Methods. 1994, 48 (2-3): 267-272. 10.1016/0166-0934(94)90125-2.
Macabeo-Ong M, Ginzinger DG, Dekker N, McMillan A, Regezi JA, Wong DT, Jordan RC: Effect of duration of fixation on quantitative reverse transcription polymerase chain reaction analyses. Mod Pathol. 2002, 15 (9): 979-987. 10.1097/01.MP.0000026054.62220.FC.
Geiss GK, Bumgarner RE, Birditt B, Dahl T, Dowidar N, Dunaway DL, Fell HP, Ferree S, George RD, Grogan T, et al: Direct multiplexed measurement of gene expression with color-coded probe pairs. Nat Biotechnol. 2008, 26 (3): 317-325. 10.1038/nbt1385.
Reis PP, Bharadwaj RR, Machado J, Macmillan C, Pintilie M, Sukhai MA, Perez-Ordonez B, Gullane P, Irish J, Kamel-Reid S: Claudin 1 overexpression increases invasion and is associated with aggressive histological features in oral squamous cell carcinoma. Cancer. 2008, 113 (11): 3169-3180. 10.1002/cncr.23934.
Cervigne NK, Reis PP, Machado J, Sadikovic B, Bradley G, Galloni NN, Pintilie M, Jurisica I, Perez-Ordonez B, Gilbert R, et al: Identification of a microRNA signature associated with progression of leukoplakia to oral carcinoma. Hum Mol Genet. 2009, 18 (24): 4818-4829. 10.1093/hmg/ddp446.
Dos Reis PP, Bharadwaj RR, Machado J, Macmillan C, Pintilie M, Sukhai MA, Perez-Ordonez B, Gullane P, Irish J, Kamel-Reid S: Claudin 1 overexpression increases invasion and is associated with aggressive histological features in oral squamous cell carcinoma. Cancer. 2008, 113 (11): 3169-3180. 10.1002/cncr.23934.
Reis PP, Tomenson M, Cervigne NK, Machado J, Jurisica I, Pintilie M, Sukhai MA, Perez-Ordonez B, Grenman R, Gilbert RW, et al: Programmed cell death 4 loss increases tumor cell invasion and is regulated by miR-21 in oral squamous cell carcinoma. Mol Cancer. 2010, 9: 238-10.1186/1476-4598-9-238.
Livak KJ, Schmittgen TD: Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 2001, 25 (4): 402-408. 10.1006/meth.2001.1262.
Rodgers JL, Nicewander WA: Thirteen ways to look at the correlation coefficient. The American Statistician. 1988, 42 (1): 59-66. 10.2307/2685263.
R Development Core Team: R: A Language and Environment for Statistical Computing. 2008, Vienna, Austria
Sanchez-Navarro I, Gamez-Pozo A, Gonzalez-Baron M, Pinto-Marin A, Hardisson D, Lopez R, Madero R, Cejas P, Mendiola M, Espinosa E, et al: Comparison of gene expression profiling by reverse transcription quantitative PCR between fresh frozen and formalin-fixed, paraffin-embedded breast cancer tissues. Biotechniques. 2010, 48 (5): 389-397. 10.2144/000113388.
Cronin M, Pho M, Dutta D, Stephans JC, Shak S, Kiefer MC, Esteban JM, Baker JB: Measurement of gene expression in archival paraffin-embedded tissues: development and performance of a 92-gene reverse transcriptase-polymerase chain reaction assay. Am J Pathol. 2004, 164 (1): 35-42. 10.1016/S0002-9440(10)63093-3.
Paik S, Shak S, Tang G, Kim C, Baker J, Cronin M, Baehner FL, Walker MG, Watson D, Park T, et al: A multigene assay to predict recurrence of tamoxifen-treated, node-negative breast cancer. N Engl J Med. 2004, 351 (27): 2817-2826. 10.1056/NEJMoa041588.
Antonov J, Goldstein DR, Oberli A, Baltzer A, Pirotta M, Fleischmann A, Altermatt HJ, Jaggi R: Reliable gene expression measurements from degraded RNA by quantitative real-time PCR depend on short amplicons and a proper normalization. Lab Invest. 2005, 85 (8): 1040-1050. 10.1038/labinvest.3700303.