Nội dung được dịch bởi AI, chỉ mang tính chất tham khảo
Quan sát các phân tử đơn của axit nucleic HIV-1 và miRNA
Tóm tắt
Sự khan hiếm của một số loại axit nucleic và kích thước nhỏ của các trình tự mục tiêu như miRNA tạo ra một rào cản lớn cho việc trực quan hóa trong tế bào và đặt ra một thách thức lớn đối với các nhà sinh物 học tế bào. Ở đây, chúng tôi cung cấp một phương pháp trực quan hóa tổng quát và rất nhạy cảm (mô hình lai huỳnh quang oligonucleotide tại chỗ, O-FISH) có thể được sử dụng để phát hiện các axit nucleic như vậy bằng cách sử dụng một mảnh oligonucleotide đơn dài từ 19-26 nucleotide. Chúng tôi đã sử dụng O-FISH để quan sát miR146a trong các tế bào người và gia cầm. Hơn nữa, chúng tôi tiết lộ độ nhạy của phát hiện O-FISH bằng cách sử dụng một hệ thống mô hình HIV-1 để cho thấy rằng chỉ cần 1-2 bản sao axit nucleic cũng có thể được phát hiện trong một tế bào đơn. Chúng tôi đã có thể phân biệt cDNA virus mới tổng hợp và, hơn nữa, nhận thấy rằng một số trình tự RNA HIV chỉ có sẵn tạm thời cho phát hiện O-FISH. Nhìn chung, những kết quả này gợi ý rằng phương pháp O-FISH có thể được sử dụng để thăm dò tại chỗ cho chỉ 1-2 bản sao axit nucleic và, thêm vào đó, để quan sát RNA nhỏ như miRNA. Chúng tôi cũng đề xuất rằng phương pháp O-FISH có thể được mở rộng để hiểu chức năng virus bằng cách thăm dò các trung gian virus mới được phiên mã; và phân biệt vị trí của các axit nucleic mà chúng ta quan tâm. Thêm vào đó, việc khảo sát cấu hình và cấu trúc của một axit nucleic cụ thể tại chỗ cũng có thể khả thi, dựa trên khả năng tiếp cận của một trình tự mục tiêu.
Từ khóa
#HIV-1 #miRNA #O-FISH #lai huỳnh quang #trực quan hóa axit nucleicTài liệu tham khảo
Femino AM, Fay FS, Fogarty K, Singer RH: Visualization of single RNA transcripts in situ. Science. 1998, 280: 585-590. 10.1126/science.280.5363.585.
Femino AM, Fogarty K, Lifshitz LM, Carrington W, Singer RH: Visualization of single molecules of mRNA in situ. Methods Enzymol. 2003, 361: 245-304.
Maamar H, Raj A, Dubnau D: Noise in gene expression determines cell fate in Bacillus subtilis. Science. 2007, 317: 526-529. 10.1126/science.1140818.
Zenklusen D, Larson DR, Singer RH: Single-RNA counting reveals alternative modes of gene expression in yeast. Nat Struct Mol Biol. 2008, 15: 1263-1271. 10.1038/nsmb.1514.
Tan RZ, van Oudenaarden A: Transcript counting in single cells reveals dynamics of rDNA transcription. Mol Syst Biol. 2010, 6: 358-
Raj A, Peskin CS, Tranchina D, Vargas DY, Tyagi S: Stochastic mRNA synthesis in mammalian cells. PLoS Biol. 2006, 4: e309-10.1371/journal.pbio.0040309.
Raj A, van den Bogaard P, Rifkin SA, van Oudenaarden A, Tyagi S: Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nat Methods. 2008, 5: 877-879. 10.1038/nmeth.1253.
Khalil AM, Guttman M, Huarte M, Garber M, Raj A, Rivea Morales D, Thomas K, Presser A, Bernstein BE, van Oudenaarden A, Regev A, Lander ES, Rinn JL: Many human large intergenic noncoding RNAs associate with chromatin-modifying complexes and affect gene expression. Proc Natl Acad Sci U S A. 2009, 106: 11667-11672. 10.1073/pnas.0904715106.
Raj A, Rifkin SA, Andersen E, van Oudenaarden A: Variability in gene expression underlies incomplete penetrance. Nature. 2010, 463: 913-918. 10.1038/nature08781.
Itzkovitz S, van Oudenaarden A: Validating transcripts with probes and imaging technology. Nat Methods. 2011, 8: S12-S19. 10.1038/nmeth.1573.
Larsson C, Grundberg I, Soderberg O, Nilsson M: In situ detection and genotyping of individual mRNA molecules. Nat Methods. 2010, 7: 395-397. 10.1038/nmeth.1448.
Player AN, Shen LP, Kenny D, Antao VP, Kolberg JA: Single-copy gene detection using branched DNA (bDNA) in situ hybridization. J Histochem Cytochem. 2001, 49: 603-612. 10.1177/002215540104900507.
Tyagi S, Kramer FR: Molecular beacons: probes that fluoresce upon hybridization. Nat Biotechnol. 1996, 14: 303-308. 10.1038/nbt0396-303.
Bertrand E, Chartrand P, Schaefer M, Shenoy SM, Singer RH, Long RM: Localization of ASH1 mRNA particles in living yeast. Mol Cell. 1998, 2: 437-445. 10.1016/S1097-2765(00)80143-4.
Chan P, Yuen T, Ruf F, Gonzalez-Maeso J, Sealfon SC: Method for multiplex cellular detection of mRNAs using quantum dot fluorescent in situ hybridization. Nucleic Acids Res. 2005, 33: e161-10.1093/nar/gni162.
Soderberg O, Gullberg M, Jarvius M, Ridderstrale K, Leuchowius KJ, Jarvius J, Wester K, Hydbring P, Bahram F, Larsson LG, Landegren : Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nat Methods. 2006, 3: 995-1000. 10.1038/nmeth947.
Paillart JC, Shehu-Xhilaga M, Marquet R, Mak J: Dimerization of retroviral RNA genomes: an inseparable pair. Nat Rev Microbiol. 2004, 2: 461-472. 10.1038/nrmicro903.
Huthoff H, Berkhout B: Two alternating structures of the HIV-1 leader RNA. Rna. 2001, 7: 143-157. 10.1017/S1355838201001881.
Huthoff H, Berkhout B: Multiple secondary structure rearrangements during HIV-1 RNA dimerization. Biochemistry. 2002, 41: 10439-10445. 10.1021/bi025993n.
Berkhout B, Ooms M, Beerens N, Huthoff H, Southern E, Verhoef K: In vitro evidence that the untranslated leader of the HIV-1 genome as an RNA checkpoint that regulates multiple functions through conformational changes. J Biol Chem. 2002, 277: 19967-19975. 10.1074/jbc.M200950200.
Paillart JC, Dettenhofer M, Yu XF, Ehresmann C, Ehresmann B, Marquet R: First snapshots of the HIV-1 RNA structure in infected cells and in virions. J Biol Chem. 2004, 279: 48397-48403. 10.1074/jbc.M408294200.
Lu K, Heng X, Garyu L, Monti S, Garcia EL, Kharytonchyk S, Dorjsuren B, Kulandaivel G, Jones S, Hiremath A, Divakaruni SS, LaCotti C, Barton S, Tummillo D, Hosic A, Edme K, Albrecht S, Telesnitsky A, Summers MF: NMR detection of structures in the HIV-1 5'-leader RNA that regulate genome packaging. Science. 2011, 334: 242-245. 10.1126/science.1210460.
Hou J, Wang P, Lin L, Liu X, Ma F, An H, Wang Z, Cao X: MicroRNA-146a feedback inhibits RIG-I-dependent Type I IFN production in macrophages by targeting TRAF6, IRAK1, and IRAK2. J Immunol. 2009, 183: 2150-2158. 10.4049/jimmunol.0900707.
Stanczyk J, Pedrioli DM, Brentano F, Sanchez-Pernaute O, Kolling C, Gay RE, Detmar M, Gay S, Kyburz D: Altered expression of MicroRNA in synovial fibroblasts and synovial tissue in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 2008, 58: 1001-1009. 10.1002/art.23386.