Miễn Dịch T-Cell Đối Với Hai Yếu Tố Tự Nhận HLA-A2-Hạn Chế Của Cyclin E Có Thể Góp Phần Đưa Đến Sự Thuyên Giảm Sau Khi Cấy Ghép Tế Bào Gốc.

Cyclin E1 (CCNE1) và cyclin E2 (CCNE2) là các gen của chu kỳ tế bào được điều chỉnh chặt chẽ trong các tế bào bình thường nhưng lại được biểu hiện quá mức và hoạt động một cách liên tục trong ung thư vú và hầu hết các bệnh lý huyết học. Để xác thực CCNE là một kháng nguyên mục tiêu tiềm năng cho T-cells trong bệnh bạch cầu, trước tiên chúng tôi đã xác nhận sự có mặt bất thường của protein CCNE1 và CCNE2 trong PBMC từ 26 (93%) trên tổng số 28 bệnh nhân (CML = 16; AML = 7; ALL =2; NHL = 3) bằng phương pháp Đốt Tây (Western Blot), so với 4 (33%) trong số 12 người khỏe mạnh làm chứng (p < 0.0005). Tiếp theo, chúng tôi đã sàng lọc các trình tự của CCNE1 và CCNE2 để tìm các mô hình liên kết HLA-A*0201 và xác định một cặp peptide đồng hình khôngamer có khả năng liên kết cao nhất với HLA-A*0201 bằng cách sử dụng thuật toán NCBI. Các peptide, được ký hiệu là CCNE1M (144ILLDWLMEV152) và CCNE2L (144ILLDWLLEV152), khác nhau ở vị trí P7 (M hoặc L), và cả hai đều khác so với trình tự của chuột tại vị trí P1 (V). Các peptide tổng hợp từ chuột và người đã được sử dụng để xác nhận sự liên kết HLA-A2 cao trong các tế bào T2 qua phân tích FACS và các tế bào T2 được đưa peptide vào đã được sử dụng để kích thích CTLs đặc hiệu với peptide từ PBMC HLA-A2+ khỏe mạnh trong vitro. Các dòng CTL CCNE1M đã tiêu diệt đặc hiệu cả các tế bào T2 nạp CCNE1M và CCNE2L, trong khi không có CTL nào có thể được kích thích với peptide của chuột. Tương tự, các dòng CTL CCNE2L kích thích đã tiêu diệt tất cả các tế bào T2 nạp CCNE1M và CCNE2L nhưng không tiêu diệt các tế bào T2 không nạp peptide. Sử dụng các tetramer CCNE1M và CCNE2L HLA-A2, chúng tôi phát hiện ra rằng mỗi tetramer đều có thể liên kết tương đương với các dòng CTL xuất phát từ CCNE1M hoặc CCNE2L, cho thấy cả hai peptide đều có thể được nhận diện chéo bởi các dòng CTL kích thích bằng một trong hai peptide. Để nghiên cứu thêm về khả năng nhận diện chéo và tiềm năng chiếm ưu thế miễn dịch của cả hai peptide cũng như để xác định hoạt động chống bệnh bạch cầu của chúng, các dòng CTL CCNE1M- và CCNE2L- đã được tạo ra thông qua xét nghiệm pha loãng giới hạn. Hai dòng CTL cụ thể với peptide từ mỗi dòng cho thấy độ tiêu diệt lần lượt là 25% và 26% các tế bào bạch cầu ở tỉ lệ E:T 10:1. Không có CTLs đặc hiệu CCNE nào thể hiện khả năng tiêu diệt các tế bào tủy xương (BM) thu được từ cùng một bệnh nhân trong thời kỳ thuyên giảm, cũng như các tế bào BM HLA-A2+ từ người hiến khỏe mạnh. Tiếp theo, chúng tôi so sánh độ avidity của thụ thể kháng nguyên T-cell (TCR) của các dòng CTL CCNE1M và CCNE2L thông qua việc đo thời gian phân tách tetramer trong nhiệt độ 25°C bằng các tetramer CCNE1M/HLA-A2 và CCNE2L/HLA-A2 (cũng như pp65/HLA-A2 kiểm soát) được phân tích qua dòng tế bào. Sự suy giảm fluorescence liên kết với tetramer - đã chuẩn hóa (so với thời gian = 0) theo thời gian là tuyến tính với từng dòng với mỗi tetramer (R2 = 0.85 đến 0.91), cho thấy rằng độ avidity của việc liên kết tetramer có thể được sử dụng để xác định chính xác độ ái lực của TCR. Hơn nữa, động lực học bậc nhất có thể được sử dụng để xác định t1/2 của mỗi dòng. Thời gian t1/2 của tetramer CCNE1M/HLA-A2 là 85 phút và 25 phút, trong khi thời gian t1/2 của CCNE1L/HLA-A2 lần lượt là 30 phút và 11 phút, cho dòng CTL CCNE1M và CCNE2L-CTL. Điều này gợi ý rằng trong khi cả hai peptide đều được nhận diện chéo bởi các dòng T-cell độc đáo (với TCR độc đáo, xác định bởi các so sánh trình tự TCR-Vβ), CCNE1M có vẻ là dominant miễn dịch. Để xác định liệu có phản ứng miễn dịch (IR) với một trong hai peptide nào xảy ra ở bệnh nhân bạch cầu hay không, chúng tôi đã nghiên cứu PBMC từ 18 bệnh nhân (10 CML; 8 ALL) trước và 3-6 tháng sau khi cấy ghép Tế bào Gốc (SCT) với xét nghiệm CCNE1M/HLA-A2- và CCNE2L/HLA-A2-tetramer. Số lượng trung bình của tế bào CTL CCNE1M-CTL và CCNE2L-CTL đã tăng sau khi SCT (p< 0.002 ở cả CTL CCNE1M và CCNE2L) so với không có thay đổi về số lượng trung bình của pp65-CTL trước/sau SCT. IR (được định nghĩa là ≥ 20% tăng trưởng CTL đặc hiệu sau SCT) đối với cả CCNE1M hoặc CCNE2L không tương quan với kiểu bệnh bạch cầu, sự khác biệt HLA giữa người hiến và người nhận (khớp hoặc không khớp), hoặc tình trạng bệnh trước SCT theo kiểm tra exact của Fisher. Tuy nhiên, trong 8 bệnh nhân CML không trong tình trạng thuyên giảm trước SCT, IR đối với CCNE1 hoặc CCNE2 xảy ra thường xuyên hơn ở những bệnh nhân đạt được sự thuyên giảm hoàn toàn (CR) so với những người không đạt CR sau SCT (100% so với 33%; p < 0.04). Những phát hiện này đã được xác nhận trong một nhóm thêm 25 bệnh nhân AML có bệnh tích hoạt động khi SCT. Để điều tra xem các CTL cụ thể với peptide có chức năng hay không, chúng tôi đã đo sản xuất IFN-γ và TNF-αa sau kích thích peptide bằng phương pháp xét nghiệm hạt Luminex và tế bào dòng nội bào cytokine (CFC). Các xét nghiệm cho thấy sự sản xuất cytokines IFN-γ và TNF-αa bởi các tế bào T sau khi kích thích bằng CCNE1M hoặc CCNE2Lpeptides. Tóm lại, các kết quả này chứng tỏ rằng CCNE1M và CCNE2L, các peptide tự nhận từ các protein chu kỳ tế bào hoạt động liên tục, là các kháng nguyên liên quan đến bệnh bạch cầu mới có thể được nghiên cứu trong các chiến lược liệu pháp miễn dịch.