Jialan Shi1, Dessislava N. Nikova2, Gary E. Gilbert1
1Medicine Departments, VA Boston Healthcare System, Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School, Boston, MA, USA
2Research, VA Boston Healthcare System and Harvard Medical School, West Roxbury, MA, USA
Tóm tắt
Tóm tắt
Hoạt tính procoagulant phụ thuộc vào phosphatidylserine (PS) đã được công nhận trong ít nhất bốn thập kỷ, nhưng vị trí của các màng sinh lý có sự phơi bày PS vẫn chưa rõ ràng. PS được phơi bày trên các tế bào chết theo chương trình và các vi hạt tế bào nhưng các nghiên cứu in vitro và in vivo không chứng minh được mối quan hệ rõ ràng giữa các vi hạt hoặc tế bào chết theo chương trình và sự lắng đọng fibrin. Sự tiếp xúc của các tế bào nội mô với các tác nhân kích thích hoặc độc tố dẫn đến sự co lại của các cạnh tế bào, sự nổi bật của tế bào trung tâm, và sự mở rộng của các filopodia. Chúng tôi cũng đã phát hiện rằng căng thẳng tế bào cũng dẫn đến sự phơi bày PS hạn chế, cục bộ. Hơn nữa, chúng tôi đã phát hiện rằng các vị trí liên kết cho lactadherin, một protein liên kết PS có sự tương đồng với yếu tố VIII và yếu tố V, được tập trung trên các bề mặt lồi như filopodia. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã hỏi liệu sự phơi bày PS hạn chế, cục bộ trên các tế bào nội mô tĩnh mạch rốn người chịu stress có đủ để hỗ trợ việc lắp ráp phức hợp prothrombinase hay không và liệu việc lắp ráp phức hợp prothrombinase có bị hạn chế ở các đặc điểm màng lồi liên kết lactadherin hay không.
Chúng tôi đã cho các tế bào nội mô tĩnh mạch rốn người (HUVEC) phát triển thành các lớp tế bào liên tục trước khi tiếp xúc với TNF-α, 10 ng/ml, trong 5–24 giờ. Sự phơi bày PS được phát hiện bằng cách nhuộm đồng thời sử dụng 10 nM lactadherin–Alexa 488 và annexin V–Cy 3.18, cả hai đều có ái lực cao với PS. Các tế bào bị căng thẳng đã rút khỏi ranh giới trước đó của chúng, để lại các fibril còn lại gắn với các điểm gắn kết ban đầu. Ngoài ra, chúng đã mở rộng filopodia dài lên đến vài đường kính tế bào. Kính hiển vi huỳnh quang đã chứng minh sự nhuộm cục bộ của filopodia, fibril và cạnh tế bào với lactadherin và các mảng gần nhân với annexin A5. Chúng tôi đã hỏi liệu việc liên kết chọn lọc có thể được xác định bởi hình thái màng hay không. Để giả lập độ cong của màng tế bào, chúng tôi đã chuẩn bị các nền silica được chế tạo ở quy mô nano với bán kính gờ là 10 nm. Hình ảnh bề mặt AFM và huỳnh quang của các lớp màng kép tổng hợp hỗ trợ bởi các nền cho thấy, với hàm lượng PS từ 4–15%, lactadherin có xu hướng liên kết ưu tiên với các gờ nano lồi với tỷ lệ nhuộm gờ: thung lũng >80:1, trong khi annexin V liên kết chọn lọc với các khu vực lõm của các rãnh nano với tỷ lệ gờ. Việc hình ảnh kết hợp huỳnh quang/AFM của HUVEC dã bị TNF-α xử lý cho thấy rằng các sợi mảnh mới nhuộm với lactadherin có bán kính cong khoảng 12 nm, tương tự như các gờ của các lớp màng tổng hợp của chúng tôi. Chúng tôi đã hỏi liệu yếu tố Va và yếu tố Xa có chia sẻ sở thích cho các bề mặt lồi, tương tự như lactadherin không. Các màng hỗ trợ 4% PS có nhuộm gờ ưu tiên với yếu tố Va-fluorescein-maleimide với tỷ lệ nhuộm gờ/thung lũng > 10/1. Việc nhuộm đồng với yếu tố Va và yếu tố Xa-EGRck-biotin (được phức hợp với Alexa 647-steptavidin) cho thấy rằng yếu tố Va đã tăng cường khả năng liên kết của yếu tố Xa đến các gờ, do đó phức hợp prothrombinase có liên kết ưu tiên cao với các gờ lồi. Các tế bào nội mô đã bị TNF-α xử lý liên kết yếu tố Va, giống như lactadherin, chọn lọc trên các filopodia và fibril gần các cạnh bị co lại của các tế bào nội mô. Yếu tố Xa cũng định vị đến các đặc điểm này trong sự hiện diện của yếu tố Va, điều này cho thấy lắp ráp phức hợp prothrombinase. Các tế bào nội mô bị căng thẳng đã thể hiện ít nhất gấp 8 lần hỗ trợ sản xuất thrombin và hoạt động prothrombinase. Hoạt động prothrombinase đã bị ức chế một cách hiệu quả bởi lactadherin, chứng minh rằng các vị trí gắn kết lactadherin là các vị trí chức năng cho hoạt động prothrombinase. Tất cả dữ liệu này cho thấy rằng các tế bào nội mô bị căng thẳng có thể hỗ trợ phức hợp prothrombinase và hoạt động prothrombinase được phân chia gần rìa tế bào và trong khu vực nội bào thông qua các vị trí gắn kết trên các đặc điểm màng lồi với PS được phơi bày. Chúng tôi đã giả thuyết rằng khu vực này của hoạt động procoagulant tương đối được bảo vệ khỏi các protein chống đông được định vị ở những nơi khác trên tế bào nội mô đã được kích thích/căng thẳng.
