Nội dung được dịch bởi AI, chỉ mang tính chất tham khảo
Biểu hiện ổn định với mức độ cao của yếu tố VIII trong tế bào buồng trứng của chuột lang Trung Quốc trong hệ thống dựa trên yếu tố kéo dài-1 alpha được cải thiện
Tóm tắt
Yếu tố VIII tái tổ hợp (FVIII), được sử dụng trong liệu pháp điều trị bệnh máu khó đông loại A, là một trong những protein điều trị khó sản xuất nhất trong các hệ thống biểu hiện dị thể. Biến thể thiếu hụt của FVIII, trong đó miền B toàn bộ được thay thế bằng một peptide liên kết ngắn, đã được phê duyệt để sử dụng y học. Hiệu quả và độ an toàn của biến thể thiếu hụt FVIII này tương tự như các chế phẩm FVIII đầy đủ, trong khi mức độ sản xuất trong tế bào CHO cao đáng kể. Mức độ sản xuất điển hình cho các dòng tế bào CHO sản xuất FVIII-BDD thiếu hụt, được mô tả ở nơi khác, là 0,5–2 IU/ml, tương ứng với nồng độ FVIII khoảng 0,2 μg/ml. Sử dụng các vectơ chuẩn dựa trên promoter cytomegalovirus (CMV) và cDNA dihydrofolate reductase, chúng tôi đã thu được dòng tế bào tiết ra 0,5 IU/ml FVIII-BDD, điều này xấp xỉ với dữ liệu đã công bố trước đó. Một hệ thống biểu hiện dựa trên trình tự gen CHO bao gồm promoter CHO-EEF1A và đoạn lặp lại đầu mút virus Epstein-Barr đã cho phép đạt được mức tăng 80 lần trong mức sản xuất so với hệ thống biểu hiện thông thường dựa trên promoter CMV. Ngay sau khi lựa chọn ban đầu, các tế bào sản xuất FVIII đã tiết ra 5–10 IU/ml FVIII-BDD, và sau khi khuếch đại đa giai đoạn với methotrexate, một dòng clon ổn định 11A4H đã được chọn, tiết ra 39 IU/ml FVIII-BDD trong các điều kiện nuôi cấy lô đơn giản, điều này vượt xa các chỉ số đã biết cho các nhà sản xuất công nghiệp của protein này. Khác với các dòng sản xuất FVIII-BDD khác, 11A4H tích tụ tỷ lệ FVIII tiết ra thấp trên màng tế bào. Năng suất của nó có thể được tăng cường khoảng gấp đôi bằng cách thêm natri butyrate và butylated hydroxyanisole vào môi trường nuôi cấy. Một quy trình tinh chế năm giai đoạn cho yếu tố VIII đã được áp dụng. Nó cho phép tách được FVIII-BDD nguyên vẹn như đã được xác nhận bởi phổ khối. FVIII-BDD tinh chế có hoạt tính đặc hiệu là 11.000 IU/mg, tương tự như các thuốc FVIII tái tổ hợp đã biết. FVIII-BDD tái tổ hợp đã được sản xuất trong tế bào CHO mà không cần thêm bất kỳ vật liệu nào có nguồn gốc từ động vật, được tinh chế và đặc trưng. Các cấu trúc gen mới cho việc biểu hiện các protein dị thể kết hợp với phương pháp nuôi cấy tối ưu đã cho phép đạt được mức tiết FVIII tái tổ hợp sinh học hoạt tính tăng gần gấp mười lần so với các chế phẩm tương tự đã được công bố trước đó.
Từ khóa
Tài liệu tham khảo
van Dieijen G, Tans G, Rosing J, Hemker HC. The role of phospholipid and factor VIIIa in the activation of bovine factor X. J Biol Chem. 1981;256(7):3433–42.
Eaton D, Rodriguez H, Vehar GA. Proteolytic processing of human factor VIII. Correlation of specific cleavages by thrombin, factor Xa, and activated protein C with activation and inactivation of factor VIII coagulant activity. Biochemistry. 1986;25(2):505–12.
Orlova NA, Kovnir SV, Vorobiev II, Gabibov AG, Vorobiev AI. Blood clotting factor VIII: from evolution to therapy. Acta Naturae. 2013;5(2):19–39.
Vehar GA, Keyt B, Eaton D, Rodriguez H, O’Brien DP, Rotblat F, Oppermann H, Keck R, Wood WI, Harkins RN, et al. Structure of human factor VIII. Nature. 1984;312(5992):337–42.
Tagliavacca L, Moon N, Dunham WR, Kaufman RJ. Identification and functional requirement of Cu(I) and its ligands within coagulation factor VIII. J Biol Chem. 1997;272(43):27428–34.
Toole JJ, Pittman DD, Orr EC, Murtha P, Wasley LC, Kaufman RJ. A large region (approximately equal to 95 kDa) of human factor VIII is dispensable for in vitro procoagulant activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 1986;83(16):5939–42.
Michnick DA, Pittman DD, Wise RJ, Kaufman RJ. Identification of individual tyrosine sulfation sites within factor VIII required for optimal activity and efficient thrombin cleavage. J Biol Chem. 1994;269(31):20095–102.
RS A, Satheeshkumar PK, Vijayalakshmi MA. Expression, purification, and partial in vitro characterization of biologically active human coagulation factor VIII light chain (A3-C1-C2) in Pichia pastoris. Appl Biochem Biotechnol. 2013;171(1):10–9.
Schwartz RS, Abildgaard CF, Aledort LM, Arkin S, Bloom AL, Brackmann HH, Brettler DB, Fukui H, Hilgartner MW, Inwood MJ, et al. Human recombinant DNA-derived antihemophilic factor (factor VIII) in the treatment of hemophilia A. recombinant factor VIII study group. N Engl J Med. 1990;323(26):1800–5.
Kaufman RJ, Wasley LC, Dorner AJ. Synthesis, processing, and secretion of recombinant human factor VIII expressed in mammalian cells. J Biol Chem. 1988;263(13):6352–62.
Pittman DD, Alderman EM, Tomkinson KN, Wang JH, Giles AR, Kaufman RJ. Biochemical, immunological, and in vivo functional characterization of B-domain-deleted factor VIII. Blood. 1993;81(11):2925–35.
Kessler CM, Gill JC, White 2nd GC, Shapiro A, Arkin S, Roth DA, Meng X, Lusher JM. B-domain deleted recombinant factor VIII preparations are bioequivalent to a monoclonal antibody purified plasma-derived factor VIII concentrate: a randomized, three-way crossover study. Haemophilia. 2005;11(2):84–91.
Lynch CM, Israel DI, Kaufman RJ, Miller AD. Sequences in the coding region of clotting factor VIII act as dominant inhibitors of RNA accumulation and protein production. Hum Gene Ther. 1993;4(3):259–72.
Hoeben RC, Fallaux FJ, Cramer SJ, van den Wollenberg DJ, van Ormondt H, Briet E, van der Eb AJ. Expression of the blood-clotting factor-VIII cDNA is repressed by a transcriptional silencer located in its coding region. Blood. 1995;85(9):2447–54.
Dorner AJ, Bole DG, Kaufman RJ. The relationship of N-linked glycosylation and heavy chain-binding protein association with the secretion of glycoproteins. J Cell Biol. 1987;105(6 Pt 1):2665–74.
Adamson R. Design and operation of a recombinant mammalian cell manufacturing process for rFVIII. Ann Hematol. 1994;68 Suppl 3:S9–S14.
Orlova NA, Kovnir SV, Hodak JA, Vorobiev II, Gabibov AG, Skryabin KG. Improved elongation factor-1 alpha-based vectors for stable high-level expression of heterologous proteins in Chinese hamster ovary cells. BMC Biotechnol. 2014;14:56.
Orlova NA, Kovnir SV, Vorobiev II, Yuriev AS, Gabibov AG, Vorobiev AI. Stable expression of recombinant factor VIII in CHO cells using methotrexate-driven transgene amplification. Acta Naturae. 2012;4(1):93–100.
Malhotra JD, Miao H, Zhang K, Wolfson A, Pennathur S, Pipe SW, Kaufman RJ. Antioxidants reduce endoplasmic reticulum stress and improve protein secretion. Proc Natl Acad Sci U S A. 2008;105(47):18525–30.
Gregory TR, Nicol JA, Tamm H, Kullman B, Kullman K, Leitch IJ, Murray BG, Kapraun DF, Greilhuber J, Bennett MD. Eukaryotic genome size databases. Nucleic Acids Res. 2007;35(Database issue):D332–8.
Dussault AA, Pouliot M. Rapid and simple comparison of messenger RNA levels using real-time PCR. Biol Proced Online. 2006;8:1–10.
Church GM, Gilbert W. Genomic sequencing. Proc Natl Acad Sci U S A. 1984;81(7):1991–5.
Thim L, Vandahl B, Karlsson J, Klausen NK, Pedersen J, Krogh TN, Kjalke M, Petersen JM, Johnsen LB, Bolt G, et al. Purification and characterization of a new recombinant factor VIII (N8). Haemophilia. 2010;16(2):349–59.
Chun BH, Park SY, Chung N, Bang WG. Enhanced production of recombinant B-domain deleted factor VIII from Chinese hamster ovary cells by propionic and butyric acids. Biotechnol Lett. 2003;25(4):315–9.
Bebbington CR, Hentschel CC. The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells. In: Glover D, editor. DNA cloning, volume III. San Diego: Academic; 1987. p. 163–88.
Brown HC, Gangadharan B, Doering CB. Enhanced biosynthesis of coagulation factor VIII through diminished engagement of the unfolded protein response. J Biol Chem. 2011;286(27):24451–7.
Palermo DP, DeGraaf ME, Marotti KR, Rehberg E, Post LE. Production of analytical quantities of recombinant proteins in Chinese hamster ovary cells using sodium butyrate to elevate gene expression. J Biotechnol. 1991;19(1):35–47.
Matsuhisa T, Okada M, Mori Y. Induction of blood coagulation factor VIII by sodium butyrate in Balb/c 3 T3 cells. Exp Cell Res. 1989;180(1):1–12.
Fallaux FJ, Hoeben RC, Cramer SJ, van den Wollenberg DJ, Briet E, van Ormondt H, van Der Eb AJ. The human clotting factor VIII cDNA contains an autonomously replicating sequence consensus- and matrix attachment region-like sequence that binds a nuclear factor, represses heterologous gene expression, and mediates the transcriptional effects of sodium butyrate. Mol Cell Biol. 1996;16(8):4264–72.
Li X, Gabriel DA. The physical exchange of factor VIII (FVIII) between von Willebrand factor and activated platelets and the effect of the FVIII B-domain on platelet binding. Biochemistry. 1997;36(35):10760–7.
Kolind MP, Norby PL, Flintegaard TV, Berchtold MW, Johnsen LB. The B-domain of Factor VIII reduces cell membrane attachment to host cells under serum free conditions. J Biotechnol. 2010;147(3–4):198–204.
Kolind MP, Norby PL, Berchtold MW, Johnsen LB. Optimisation of the Factor VIII yield in mammalian cell cultures by reducing the membrane bound fraction. J Biotechnol. 2011;151(4):357–62.
Annex I summary of product characteristics [http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/EPAR_-_Product_Information/human/000232/WC500049008.pdf]. Accessed 20 Mar 2017.