Nội dung được dịch bởi AI, chỉ mang tính chất tham khảo
Viên nang vi thủy gel ổn định và thẩm thấu chọn lọc cho nuôi cấy tế bào quy mô lớn và phân tích enzym
Tóm tắt
Việc thu nhỏ thể tích phản ứng sinh hóa trong các ngăn vi nhân tạo đã là động lực chính cho sự tiến hóa có định hướng của một số chất xúc tác trong hai thập kỷ qua. Thông thường, các tế bào đơn lẻ được chứa chung trong các giọt nhũ tương nước-trong-dầu với một chất nền phát huỳnh quang, sự chuyển đổi của chúng cho phép xác định các chất xúc tác có hiệu suất cải thiện. Tuy nhiên, các công nghệ dựa trên giọt nhũ tương ngăn cản sự sinh sản tế bào đến mật độ cao và cản trở khả năng thực hiện các phản ứng sinh hóa cần trao đổi các chất nền phân tử nhỏ. Tại đây, chúng tôi báo cáo về sự phát triển một phương pháp sàng lọc có năng suất cao mà giải quyết những nhược điểm này và dựa trên một viên nang vi polymer thẩm thấu chọn lọc mới. Viên nang vi chitosan alginate phủ polyelectrolyte có ruột rỗng (HC-PCAMs) với tính thẩm thấu chọn lọc đã được xây dựng thành công bằng công nghệ phân tách dòng và công nghệ lớp trên lớp (LBL). Chúng tôi chứng minh rằng HC-PCAMs phục vụ như những thùng chứa thu nhỏ cho việc bao bọc tế bào đơn lẻ, cho phép tế bào phát triển đến mật độ cao và ly giải tế bào để tạo ra các khoang lysat tế bào đơn dòng phù hợp cho phân tích quy mô lớn bằng cách sử dụng máy phân loại hạt lớn (COPAS). Tính khả thi của việc sử dụng HC-PCAMs như các khoang phản ứng trao đổi các chất nền phân tử nhỏ đã được chứng minh bằng việc sử dụng phản ứng transpeptidation được xúc tác bởi enzyme loại liên kết sortase F từ P. acnes. Vỏ polyelectrolyte bao quanh viên nang cho phép một chất nền peptide được đánh dấu huỳnh quang đi vào viên nang và tham gia vào phản ứng transpeptidation được xúc tác bởi enzyme sortase biểu hiện trong tế bào bị giữ bên trong viên nang khi ly giải tế bào. Việc giữ lại đặc biệt các sản phẩm transpeptidation phát huỳnh quang bên trong viên nang đã cho phép liên kết hoạt động sortase với tín hiệu phát huỳnh quang và cho phép tách biệt rõ ràng các viên nang thể hiện kiểu hoang dã SrtF khỏi các viên nang thể hiện biến thể không hoạt động. Một phương pháp mới dựa trên viên nang vi gel polymer đã được phát triển, cho phép phân tích quy mô lớn dựa trên việc bao bọc tế bào đơn lẻ. Phương pháp này đã được xác thực cho hoạt động transpeptidation của các enzyme sortase và thể hiện là một công cụ mạnh mẽ để sàng lọc các thư viện sortase, các enzyme hình thành liên kết khác, cũng như khả năng liên kết trong các thí nghiệm tiến hóa có định hướng. Hơn nữa, các viên nang thẩm thấu chọn lọc bao bọc các vi thuộc địa cung cấp một phương tiện mới và hiệu quả để chuẩn bị các chất xúc tác sinh học và cảm biến sinh học mới.
Từ khóa
#vi nang polymer thẩm thấu chọn lọc #nuôi cấy tế bào #phân tích enzym #phản ứng transpeptidation #sortaseTài liệu tham khảo
Wu G, Doberstein SK. HTS technologies in biopharmaceutical discovery. Drug Discov Today. 2006;11:718–24.
Wójcik M, Telzerow A, Quax W, Boersma Y. High-throughput screening in protein engineering: recent advances and future perspectives. IJMS. 2015;16:24918–45.
Macarron R, Banks M, Bojanic D, Burns D, Cirovic D, Garyantes T, et al. Impact of high-throughput screening in biomedical research. Nat Rev Drug Discovery. 2011;10:188–95.
Lindström S, Andersson-Svahn H. Miniaturization of biological assays—overview on microwell devices for single-cell analyses. Biochimica et Biophysica Acta BBA General Subjects. 2011;1810:308–16.
Upadhaya S, Selvaganapathy PR. Miniaturized microfluidic formats for cell-based high-throughput screening. Crit Rev Biomed Eng. 2009;37:193–257.
Grün D, van Oudenaarden A. Design and analysis of single-cell sequencing experiments. Cell. 2015;163:799–810.
Vanella R, Ta DT, Nash MA. Enzyme-mediated hydrogel encapsulation of single cells for high-throughput screening and directed evolution of oxidoreductases. Biotechnol Bioeng. 2019;116:1878–86.
Longwell CK, Labanieh L, Cochran JR. High-throughput screening technologies for enzyme engineering. Curr Opin Biotechnol. 2017;48:196–202.
Scott DJ, Plückthun A. Direct molecular evolution of detergent-stable G protein-coupled receptors using polymer encapsulated cells. J Mol Biol. 2013;425:662–77.
Agresti JJ, Antipov E, Abate AR, Ahn K, Rowat AC, Baret J-C, et al. Ultrahigh-throughput screening in drop-based microfluidics for directed evolution. Proc Natl Acad Sci USA. 2010;107:4004–9.
Price AK, Paegel BM. Discovery in droplets. Anal Chem. 2016;88:339–53.
Leemhuis H, Stein V, Griffiths A, Hollfelder F. New genotype–phenotype linkages for directed evolution of functional proteins. Curr Opin Struct Biol. 2005;15:472–8.
Tawfik DS, Griffiths AD. Man-made cell-like compartments for molecular evolution. Nat Biotechnol. 1998;16:652–6.
Ghadessy FJ, Ong JL, Holliger P. Directed evolution of polymerase function by compartmentalized self-replication. Proc Natl Acad Sci. 2001;98:4552–7.
Mastrobattista E, Taly V, Chanudet E, Treacy P, Kelly BT, Griffiths AD. High-throughput screening of enzyme libraries: in vitro evolution of a β-galactosidase by fluorescence-activated sorting of double emulsions. Chem Biol. 2005;12:1291–300.
Aharoni A, Amitai G, Bernath K, Magdassi S, Tawfik DS. High-throughput screening of enzyme libraries: thiolactonases evolved by fluorescence-activated sorting of single cells in emulsion compartments. Chem Biol. 2005;12:1281–9.
Beneyton T, Coldren F, Baret J-C, Griffiths AD, Taly V. CotA laccase: high-throughput manipulation and analysis of recombinant enzyme libraries expressed in E. coli using droplet-based microfluidics. Analyst. 2014;139:3314–23.
Debon A, Pott M, Obexer R, Green AP, Friedrich L, Griffiths AD, et al. Ultrahigh-throughput screening enables efficient single-round oxidase remodelling. Nat Catal. 2019;2:740–7.
Obexer R, Godina A, Garrabou X, Mittl PRE, Baker D, Griffiths AD, et al. Emergence of a catalytic tetrad during evolution of a highly active artificial aldolase. Nat Chem. 2017;9:50–6.
Cohen HM, Tawfik DS, Griffiths AD. Altering the sequence specificity of HaeIII methyltransferase by directed evolution using in vitro compartmentalization. Protein Eng Des Sel. 2004;17:3–11.
Gielen F, Hours R, Emond S, Fischlechner M, Schell U, Hollfelder F. Ultrahigh-throughput–directed enzyme evolution by absorbance-activated droplet sorting (AADS). PNAS Natl Acad Sci. 2016;113:E7383–9.
Wang BL, Ghaderi A, Zhou H, Agresti J, Weitz DA, Fink GR, et al. Microfluidic high-throughput culturing of single cells for selection based on extracellular metabolite production or consumption. Nat Biotechnol. 2014;32:473–8.
Jakiela S, Kaminski TS, Cybulski O, Weibel DB, Garstecki P. Bacterial growth and adaptation in microdroplet chemostats. Angew Chem Int Ed. 2013;52:8908–11.
Peppas NA, Hilt JZ, Khademhosseini A, Langer R. Hydrogels in biology and medicine: from molecular principles to bionanotechnology. Adv Mater. 2006;18:1345–60.
Ahmed EM. Hydrogel: preparation, characterization, and applications: a review. J Adv Res. 2015;6:105–21.
Zhu Z, Yang CJ. Hydrogel droplet microfluidics for high-throughput single molecule/cell analysis. Acc Chem Res. 2017;50:22–31.
Wechsler ME, Stephenson RE, Murphy AC, Oldenkamp HF, Singh A, Peppas NA. Engineered microscale hydrogels for drug delivery, cell therapy, and sequencing. Biomed Microdevices. 2019;21:31.
Serizawa T, Sakaguchi H, Matsusaki M, Akashi M. Polyelectrolyte multilayers prepared on hydrogel surfaces. J Polym Sci, Part A: Polym Chem. 2005;43:1062–7.
Mak WC, Cheung KY, Trau D. Diffusion controlled and temperature stable microcapsule reaction compartments for high-throughput microcapsule-PCR. Adv Funct Mater. 2008;18:2930–7.
Fischlechner M, Schaerli Y, Mohamed MF, Patil S, Abell C, Hollfelder F. Evolution of enzyme catalysts caged in biomimetic gel-shell beads. Nat Chem. 2014;6:791–6.
Gåserød O, Smidsrød O, Skjask-Brñk G. Microcapsules of alginate-chitosan–I: a quantitative study of the interaction between alginate and chitosan. Biomaterials. 1998;19:1815–25.
Gåserød O, Skjask-Brñk G, Sannes A. Microcapsules of alginate–chitosan. II. A study of capsule stability and permeability. Biomaterials. 1999;20:773–83.
Collins DJ, Neild A, deMello A, Liu A-Q, Ai Y. The Poisson distribution and beyond: methods for microfluidic droplet production and single cell encapsulation. Lab Chip. 2015;15:3439–59.
Walser M, Leibundgut RM, Pellaux R, Panke S, Held M. Isolation of monoclonal microcarriers colonized by fluorescent E. coli. Cytometry Part A. 2008;73A:788–98.
Wang H, Cheng H, Wang F, Wei D, Wang X. An improved 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT) reduction assay for evaluating the viability of Escherichia coli cells. J Microbiol Methods. 2010;82:330–3.
Popp MW, Antos JM, Grotenbreg GM, Spooner E, Ploegh HL. Sortagging: a versatile method for protein labeling. Nat Chem Biol. 2007;3(11):707–8.
Antos JM, Truttmann MC, Ploegh HL. Recent advances in sortase-catalyzed ligation methodology. Curr Opin Struct Biol. 2016;38:111–8.
Antos JM, Ingram J, Fang T, Pishesha N, Truttmann MC, Ploegh HL. Site-specific protein labeling via sortase-mediated transpeptidation. Curr Protoc Protein Sci. 2017;89:15.3.1–3.19.
Beerli RR, Hell T, Merkel AS, Grawunder U. Sortase enzyme-mediated generation of site-specifically conjugated antibody drug conjugates with high in vitro and in vivo potency. PLoS ONE. 2015;10:e0131177.
Levary DA, Parthasarathy R, Boder ET, Ackerman ME. Protein-protein fusion catalyzed by sortase A. PLoS ONE. 2011;6:e18342.
Chan L, Cross HF, She JK, Cavalli G, Martins HFP, Neylon C. Covalent attachment of proteins to solid supports and surfaces via sortase-mediated ligation. PLoS ONE. 2007;2:e1164.
Raeeszadeh-Sarmazdeh M, Parthasarathy R, Boder ET. Site-specific immobilization of protein layers on gold surfaces via orthogonal sortases. Colloids Surf B. 2015;128:457–63.
Zhang J, Yamaguchi S, Nagamune T. Sortase A-mediated synthesis of ligand-grafted cyclized peptides for modulating a model protein-protein interaction. Biotechnol J. 2015;10:1499–505.
Antos JM, Popp MWL, Ernst R, Chew GL, Spooner E, Ploegh HL. A straight path to circular proteins. J Biol Chem. 2009;284:16028–36.
Chen I, Dorr BM, Liu DR. A general strategy for the evolution of bond-forming enzymes using yeast display. Proc Natl Acad Sci. 2011;108:11399–404.
Di Girolamo S, Puorger C, Castiglione M, Vogel MS, Gebleux R, Briendl M, et al. Characterization of the housekeeping sortase from the human pathogen Propionibacterium acnes—first investigation of a class F sortase. Biochem J. 2019;476(4):665–82.
Piotukh K, Geltinger B, Heinrich N, Gerth F, Beyermann M, Freund C, et al. Directed evolution of sortase A mutants with altered substrate selectivity profiles. J Am Chem Soc. 2011;133:17536–9.
Utech S, Prodanovic R, Mao AS, Ostafe R, Mooney DJ, Weitz DA. Microfluidic generation of monodisperse, structurally homogeneous alginate microgels for cell encapsulation and 3D cell culture. Adv Healthcare Mater. 2015;4:1628.
Akbari S, Pirbodaghi T. Microfluidic encapsulation of cells in alginate particles via an improved internal gelation approach. Microfluid Nanofluid. 2014;16:773–7.
Geertsma ER. FX cloning: a versatile high-throughput cloning system for characterization of enzyme variants. Enzyme engineering. Totowa: Humana Press; 2013. p. 133–48.