Đặc trưng của các isoform phiên mã được chỉnh sửa bằng CRISPR ở mức độ đơn bào với công nghệ giải trình tự nanopore

Genome Biology - Tập 22 - Trang 1-16 - 2021
Heon Seok Kim1, Susan M. Grimes1, Anna C. Hooker1, Billy T. Lau1, Hanlee P. Ji1
1Division of Oncology, Department of Medicine, Stanford University School of Medicine, Stanford, USA

Tóm tắt

Chúng tôi đã phát triển một phương pháp tiếp cận ở mức độ đơn bào để phát hiện cấu trúc phiên mã mRNA được chỉnh sửa bằng CRISPR. Phương pháp này đánh giá cách mà các biến thể gen tại các vị trí cắt nối và các yếu tố cắt nối góp phần vào các isoform mRNA thay thế. Chúng tôi xác định cách cắt nối thay thế được điều chỉnh bằng cách chỉnh sửa các đoạn exon-intron mục tiêu hoặc các yếu tố cắt nối bằng CRISPR-Cas9 và những hệ quả của nó lên hồ sơ phiên mã. Phương pháp của chúng tôi kết hợp giải trình tự đọc dài để xác định cấu trúc phiên mã và giải trình tự đọc ngắn để khớp với hồ sơ biểu hiện gen của từng tế bào và trình tự gRNA, do đó cung cấp các chỉnh sửa gen có mục tiêu và phát hiện cấu trúc isoform phiên mã ở độ phân giải tế bào đơn.

Từ khóa

#CRISPR #mRNA #phiên mã #isoform #cắt nối #giải trình tự nanopore

Tài liệu tham khảo

Gazzara MR, Mallory MJ, Roytenberg R, Lindberg JP, Jha A, Lynch KW, et al. Ancient antagonism between CELF and RBFOX families tunes mRNA splicing outcomes. Genome Res. 2017;27(8):1360–70. https://doi.org/10.1101/gr.220517.117. Bebee TW, Park JW, Sheridan KI, Warzecha CC, Cieply BW, Rohacek AM, et al. The splicing regulators Esrp1 and Esrp2 direct an epithelial splicing program essential for mammalian development. Elife. 2015;4:e08954. https://doi.org/10.7554/eLife.08954. Macosko EZ, Basu A, Satija R, Nemesh J, Shekhar K, Goldman M, et al. Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets. Cell. 2015;161(5):1202–14. https://doi.org/10.1016/j.cell.2015.05.002. Klein AM, Mazutis L, Akartuna I, Tallapragada N, Veres A, Li V, et al. Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells. Cell. 2015;161(5):1187–201. https://doi.org/10.1016/j.cell.2015.04.044. Singh M, Al-Eryani G, Carswell S, Ferguson JM, Blackburn J, Barton K, et al. High-throughput targeted long-read single cell sequencing reveals the clonal and transcriptional landscape of lymphocytes. Nat Commun. 2019;10(1):3120. https://doi.org/10.1038/s41467-019-11049-4. Gupta I, Collier PG, Haase B, Mahfouz A, Joglekar A, Floyd T, et al. Single-cell isoform RNA sequencing characterizes isoforms in thousands of cerebellar cells. Nat Biotechnol. 2018;36(12):1197–202. https://doi.org/10.1038/nbt.4259. Jaitin DA, Weiner A, Yofe I, Lara-Astiaso D, Keren-Shaul H, David E, et al. Dissecting immune circuits by linking CRISPR-pooled screens with single-cell RNA-Seq. Cell. 2016;167(7):1883–96 e1815. https://doi.org/10.1016/j.cell.2016.11.039. Dixit A, Parnas O, Li B, Chen J, Fulco CP, Jerby-Arnon L, et al. Perturb-Seq: dissecting molecular circuits with scalable single-cell RNA profiling of pooled genetic screens. Cell. 2016;167(7):1853–66 e1817. https://doi.org/10.1016/j.cell.2016.11.038. Datlinger P, Rendeiro AF, Schmidl C, Krausgruber T, Traxler P, Klughammer J, et al. Pooled CRISPR screening with single-cell transcriptome readout. Nat Methods. 2017;14(3):297–301. https://doi.org/10.1038/nmeth.4177. Adamson B, Norman TM, Jost M, Cho MY, Nunez JK, Chen Y, et al. A multiplexed single-cell CRISPR screening platform enables systematic dissection of the unfolded protein response. Cell. 2016;167(7):1867–82 e1821. https://doi.org/10.1016/j.cell.2016.11.048. Wick RR, Judd LM, Holt KE. Performance of neural network basecalling tools for Oxford Nanopore sequencing. Genome Biol. 2019;20(1):129. https://doi.org/10.1186/s13059-019-1727-y. Li H. Minimap2: pairwise alignment for nucleotide sequences. Bioinformatics. 2018;34(18):3094–100. https://doi.org/10.1093/bioinformatics/bty191. Salton G, Buckley C. Global text matching for information retrieval. Science. 1991;253(5023):1012–5. https://doi.org/10.1126/science.253.5023.1012. Hermiston ML, Xu Z, Weiss A. CD45: a critical regulator of signaling thresholds in immune cells. Annu Rev Immunol. 2003;21(1):107–37. https://doi.org/10.1146/annurev.immunol.21.120601.140946. Oberdoerffer S, Moita LF, Neems D, Freitas RP, Hacohen N, Rao A. Regulation of CD45 alternative splicing by heterogeneous ribonucleoprotein, hnRNPLL. Science. 2008;321(5889):686–91. https://doi.org/10.1126/science.1157610. ten Dam GB, Zilch CF, Wallace D, Wieringa B, Beverley PC, Poels LG, et al. Regulation of alternative splicing of CD45 by antagonistic effects of SR protein splicing factors. J Immunol. 2000;164(10):5287–95. https://doi.org/10.4049/jimmunol.164.10.5287. Replogle JM, Norman TM, Xu A, Hussmann JA, Chen J, Cogan JZ, et al. Combinatorial single-cell CRISPR screens by direct guide RNA capture and targeted sequencing. Nat Biotechnol. 2020;38(8):954–61. https://doi.org/10.1038/s41587-020-0470-y. Topp JD, Jackson J, Melton AA, Lynch KW. A cell-based screen for splicing regulators identifies hnRNP LL as a distinct signal-induced repressor of CD45 variable exon 4. RNA. 2008;14(10):2038–49. https://doi.org/10.1261/rna.1212008. Koretzky GA, Picus J, Schultz T, Weiss A. Tyrosine phosphatase CD45 is required for T-cell antigen receptor and CD2-mediated activation of a protein tyrosine kinase and interleukin 2 production. Proc Natl Acad Sci U S A. 1991;88(6):2037–41. https://doi.org/10.1073/pnas.88.6.2037. Li J, Yu P. Genome-wide transcriptome analysis identifies alternative splicing regulatory network and key splicing factors in mouse and human psoriasis. Sci Rep. 2018;8(1):4124. https://doi.org/10.1038/s41598-018-22284-y. Stuart T, Butler A, Hoffman P, Hafemeister C, Papalexi E, Mauck WM 3rd, et al. Comprehensive integration of single-cell data. Cell. 2019;177(7):1888–902 e1821. https://doi.org/10.1016/j.cell.2019.05.031. McGinnis CS, Murrow LM, Gartner ZJ. DoubletFinder: doublet detection in single-cell RNA sequencing data using artificial nearest neighbors. Cell Syst. 2019;8(4):329–37 e324. https://doi.org/10.1016/j.cels.2019.03.003. Kim HS, Grimes SM, Hooker AC, Lau BT, Ji HP. Single cell characterization of CRISPR-modified transcript isoforms with nanopore sequencing. Dataset. Sequence Read Archive (SRA). https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA708300. Kim HS, Grimes SM, Hooker AC, Lau BT, Ji HP. Single cell characterization of CRISPR-modified transcript isoforms with nanopore sequencing. Github. https://github.com/sgtc-stanford/scCRISPR. Kim HS, Grimes SM, Hooker AC, Lau BT, Ji HP. Single cell characterization of CRISPR-modified transcript isoforms with nanopore sequencing. Zenodo. https://zenodo.org/badge/latestdoi/365008149. https://doi.org/10.5281/zenodo.5711771.