Nội dung được dịch bởi AI, chỉ mang tính chất tham khảo
SHuffle, một chủng vi khuẩn Escherichia coli mới có khả năng gập đúng cấu trúc các protein liên kết disulfide trong tế bào chất
Tóm tắt
Việc sản xuất các protein có liên kết disulfide đúng cách với năng suất cao vẫn là một thách thức. Việc biểu hiện protein tái tổ hợp trong vi khuẩn Escherichia coli là lựa chọn phổ biến, đặc biệt trong cộng đồng nghiên cứu. Trong khi nhu cầu ngày càng tăng đối với các chủng biểu hiện mới, rất ít chủng được dành riêng cho các sửa đổi sau dịch mã, chẳng hạn như sự hình thành liên kết disulfide. Do đó, các chủng biểu hiện protein mới cần phải được thiết kế và các yếu tố liên quan đến việc sản xuất protein có liên kết disulfide cần được hiểu rõ. Chúng tôi đã thiết kế một chủng vi khuẩn E. coli mới có tên là SHuffle, chuyên biệt cho việc sản xuất protein hoạt động với liên kết disulfide đúng cách với năng suất cao trong tế bào chất. Chủng này dựa trên chủng ức chế trxB gor SMG96, nơi mà các con đường khử trong tế bào chất đã bị giảm, cho phép hình thành các liên kết disulfide trong tế bào chất. Chúng tôi đã cải tiến hơn nữa bằng cách tích hợp vào nhiễm sắc thể của nó một isomerase disulfide không có chuỗi tín hiệu, DsbC. Chúng tôi đã kiểm tra trạng thái redox của DsbC trong môi trường oxy hóa của tế bào chất và đánh giá vai trò của nó trong việc hỗ trợ hình thành các protein gập đúng với nhiều liên kết disulfide. Chúng tôi đã tối ưu hóa các điều kiện biểu hiện protein, thay đổi nhiệt độ, điều kiện kích thích, nền chủng và đồng biểu hiện các protein hỗ trợ khác nhau. Chúng tôi phát hiện rằng nhiệt độ có ảnh hưởng lớn nhất đến việc cải thiện năng suất và rằng nền chủng E. coli B của chủng này vượt trội hơn so với phiên bản K12. Chúng tôi cũng phát hiện rằng việc tự biểu hiện các protein mục tiêu trên cơ sở này dẫn đến năng suất cao hơn của protein tinh khiết hoạt động. Cuối cùng, chúng tôi thấy rằng việc đồng biểu hiện các thioredoxin đột biến và các homolog PDI đã cải thiện năng suất của các protein mục tiêu khác nhau. Công trình này là sự định tính đầu tiên toàn diện về chủng ức chế trxB gor. Kết quả được trình bày sẽ giúp các nhà nghiên cứu thiết kế các điều kiện biểu hiện protein thích hợp khi sử dụng các chủng SHuffle.
Từ khóa
Tài liệu tham khảo
Wong JW, Ho SY, Hogg PJ: Disulfide bond acquisition through eukaryotic protein evolution. Mol Biol Evol 2010, 28:327–334.
Reuters: The therapeutic proteins outlook to 2007: An analysis of leading products and late-stage pipeline developments.Reuters Business Insight. London, UK; 2003.
Bardwell JC, McGovern K, Beckwith J: Identification of a protein required for disulfide bond formation in vivo. Cell 1991, 67:581–589.
Weissman JS, Kim PS: Efficient catalysis of disulphide bond rearrangements by protein disulphide isomerase. Nature 1993, 365:185–188.
Derman AI, Prinz WA, Belin D, Beckwith J: Mutations that allow disulfide bond formation in the cytoplasm of Escherichia coli. Science 1993, 262:1744–1747.
Stewart EJ, Aslund F, Beckwith J: Disulfide bond formation in the Escherichia coli cytoplasm: an in vivo role reversal for the thioredoxins. EMBO J 1998, 17:5543–5550.
Ritz D, Lim J, Reynolds CM, Poole LB, Beckwith J: Conversion of a peroxiredoxin into a disulfide reductase by a triplet repeat expansion. Science 2001, 294:158–160.
Bessette PH, Aslund F, Beckwith J, Georgiou G: Efficient folding of proteins with multiple disulfide bonds in the Escherichia coli cytoplasm. Proc Natl Acad Sci U S A 1999, 96:13703–13708.
Levy R, Weiss R, Chen G, Iverson BL, Georgiou G: Production of correctly folded Fab antibody fragment in the cytoplasm of Escherichia coli trxB gor mutants via the coexpression of molecular chaperones. Protein Expr Purif 2001, 23:338–347.
Collet JF, Messens J: Structure, function, and mechanism of thioredoxin proteins. Antioxid Redox Signal 2010, 13:1205–1216.
Devi VS, Mittl PR: Monitoring the disulfide bond formation of a cysteine-rich repeat protein from Helicobacter pylori in the periplasm of Escherichia coli. Curr Microbiol 2011, 62:903–907.
Berkmen M, Boyd D, Beckwith J: The nonconsecutive disulfide bond of Escherichia coli phytase (AppA) renders it dependent on the protein-disulfide isomerase, DsbC. J Biol Chem 2005, 280:11387–11394.
Shevchik VE, Condemine G, Robert-Baudouy J: Characterization of DsbC, a periplasmic protein of Erwinia chrysanthemi and Escherichia coli with disulfide isomerase activity. EMBO J 1994, 13:2007–2012.
Missiakas D, Georgopoulos C, Raina S: The Escherichia coli dsbC (xprA) gene encodes a periplasmic protein involved in disulfide bond formation. EMBO J 1994, 13:2013–2020.
McCarthy AA, Haebel PW, Torronen A, Rybin V, Baker EN, Metcalf P: Crystal structure of the protein disulfide bond isomerase, DsbC, from Escherichia coli. Nat Struct Biol 2000, 7:196–199.
Chen J, Song JL, Zhang S, Wang Y, Cui DF, Wang CC: Chaperone activity of DsbC. J Biol Chem 1999, 274:19601–19605.
Qiu J, Swartz JR, Georgiou G: Expression of active human tissue-type plasminogen activator in Escherichia coli. Appl Environ Microbiol 1998, 64:4891–4896.
Kurokawa Y, Yanagi H, Yura T: Overproduction of bacterial protein disulfide isomerase (DsbC) and its modulator (DsbD) markedly enhances periplasmic production of human nerve growth factor in Escherichia coli. J Biol Chem 2001, 276:14393–14399.
Jurado P, Ritz D, Beckwith J, de Lorenzo V, Fernandez LA: Production of functional single-chain Fv antibodies in the cytoplasm of Escherichia coli. J Mol Biol 2002, 320:1–10.
Yuan S, Duan H, Liu C, Liu X, Liu T, Tao H, Zhang Z: The role of thioredoxin and disulfide isomerase in the expression of the snake venom thrombin-like enzyme calobin in Escherichia coli BL21 (DE3). Protein Expr Purif 2004, 38:51–60.
Yang J, Kanter G, Voloshin A, Levy R, Swartz JR: Expression of active murine granulocyte-macrophage colony-stimulating factor in an Escherichia coli cell-free system. Biotechnol Prog 2004, 20:1689–1696.
Zawada JF, Yin G, Steiner AR, Yang J, Naresh A, Roy SM, Gold DS, Heinsohn HG, Murray CJ: Microscale to manufacturing scale-up of cell-free cytokine production-a new approach for shortening protein production development timelines. Biotechnol Bioeng 2011, 108:1570–1578.
Gurmu D, Lu J, Johnson KA, Nordlund P, Holmgren A, Erlandsen H: The crystal structure of the protein YhaK from Escherichia coli reveals a new subclass of redox sensitive enterobacterial bicupins. Proteins 2009, 74:18–31.
Choi H, Kim S, Mukhopadhyay P, Cho S, Woo J, Storz G, Ryu SE: Structural basis of the redox switch in the OxyR transcription factor. Cell 2001, 105:103–113.
Locker JK, Griffiths G: An unconventional role for cytoplasmic disulfide bonds in vaccinia virus proteins. J Cell Biol 1999, 144:267–279.
Ortenberg R, Gon S, Porat A, Beckwith J: Interactions of glutaredoxins, ribonucleotide reductase, and components of the DNA replication system of Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A 2004, 101:7439–7444.
Bessette PH, Qiu J, Bardwell JC, Swartz JR, Georgiou G: Effect of sequences of the active-site dipeptides of DsbA and DsbC on in vivo folding of multidisulfide proteins in Escherichia coli. J Bacteriol 2001, 183:980–988.
Nguyen VD, Hatahet F, Salo KE, Enlund E, Zhang C, Ruddock LW: Pre-expression of a sulfhydryl oxidase significantly increases the yields of eukaryotic disulfide bond containing proteins expressed in the cytoplasm of E.coli. Microb Cell Fact 2011, 10:1.
Hatahet F, Nguyen VD, Salo KE, Ruddock LW: Disruption of reducing pathways is not essential for efficient disulfide bond formation in the cytoplasm of E. coli. Microb Cell Fact 2010, 9:67.
Veggiani G, Marco A: Improved quantitative and qualitative production of single-domain intrabodies mediated by the co-expression of Erv1p sulfhydryl oxidase. Protein Expr Purif 2011, 111:114.
Hirvonen CA, Ross W, Wozniak CE, Marasco E, Anthony JR, Aiyar SE, Newburn VH, Gourse RL: Contributions of UP elements and the transcription factor FIS to expression from the seven rrn P1 promoters in Escherichia coli. J Bacteriol 2001, 183:6305–6314.
Faulkner MJ, Veeravalli K, Gon S, Georgiou G, Beckwith J: Functional plasticity of a peroxidase allows evolution of diverse disulfide-reducing pathways. Proc Natl Acad Sci U S A 2008, 105:6735–6740.
Rathnayaka T, Tawa M, Sohya S, Yohda M, Kuroda Y: Biophysical characterization of highly active recombinant Gaussia luciferase expressed in Escherichia coli. Biochim Biophys Acta 2010, 1804:1902–1907.
Stewart EJ, Katzen F, Beckwith J: Six conserved cysteines of the membrane protein DsbD are required for the transfer of electrons from the cytoplasm to the periplasm of Escherichia coli. EMBO J 1999, 18:5963–5971.
Kohda J, Kawahara N, Fukuda H, Kondo A: Effect of oxidized and reduced forms of Escherichia coli DsbC on protein refolding. J Biosci Bioeng 2002, 94:130–134.
Liu X, Wang CC: Disulfide-dependent folding and export of Escherichia coli DsbC. J Biol Chem 2001, 276:1146–1151.
Bader MW, Hiniker A, Regeimbal J, Goldstone D, Haebel PW, Riemer J, Metcalf P, Bardwell JC: Turning a disulfide isomerase into an oxidase: DsbC mutants that imitate DsbA. EMBO J 2001, 20:1555–1562.
Schein CH: Optimizing protein folding to the native state in bacteria. Curr Opin Biotechnol 1991, 2:746–750.
Studier FW: Protein production by auto-induction in high density shaking cultures. Protein Expr Purif 2005, 41:207–234.
Molloy PE, Harris WJ, Strachan G, Watts C, Cunningham C: Production of soluble single-chain T-cell receptor fragments in Escherichia coli trxB mutants. Mol Immunol 1998, 35:73–81.
Waldo GS, Standish BM, Berendzen J, Terwilliger TC: Rapid protein-folding assay using green fluorescent protein. Nat Biotechnol 1999, 17:691–695.
Freedman RB, Hirst TR, Tuite MF: Protein disulphide isomerase: building bridges in protein folding. Trends Biochem Sci 1994, 19:331–336.
Zhan X, Schwaller M, Gilbert HF, Georgiou G: Facilitating the formation of disulfide bonds in the Escherichia coli periplasm via coexpression of yeast protein disulfide isomerase. Biotechnol Prog 1999, 15:1033–1038.
Chakravarthi S, Jessop CE, Willer M, Stirling CJ, Bulleid NJ: Intracellular catalysis of disulfide bond formation by the human sulfhydryl oxidase, QSOX1. Biochem J 2007, 404:403–411.
Rancy PC, Thorpe C: Oxidative protein folding in vitro: a study of the cooperation between quiescin-sulfhydryl oxidase and protein disulfide isomerase. Biochemistry 2008, 47:12047–12056.
Pedone E, D’Ambrosio K, De Simone G, Rossi M, Pedone C, Bartolucci S: Insights on a new PDI-like family: structural and functional analysis of a protein disulfide oxidoreductase from the bacterium Aquifex aeolicus. J Mol Biol 2006, 356:155–164.
D’Ambrosio K, Pedone E, Langella E, De Simone G, Rossi M, Pedone C, Bartolucci S: A novel member of the protein disulfide oxidoreductase family from Aeropyrum pernix K1: structure, function and electrostatics. J Mol Biol 2006, 362:743–752.
Beeby M, O’Connor BD, Ryttersgaard C, Boutz DR, Perry LJ, Yeates TO: The genomics of disulfide bonding and protein stabilization in thermophiles. PLoS Biol 2005, 3:e309.
Dyson MR, Shadbolt SP, Vincent KJ, Perera RL, McCafferty J: Production of soluble mammalian proteins in Escherichia coli: identification of protein features that correlate with successful expression. BMC Biotechnol 2004, 4:32.
Hayhurst A: Improved expression characteristics of single-chain Fv fragments when fused downstream of the Escherichia coli maltose-binding protein or upstream of a single immunoglobulin-constant domain. Protein Expr Purif 2000, 18:1–10.
Jarchow S, Luck C, Gorg A, Skerra A: Identification of potential substrate proteins for the periplasmic Escherichia coli chaperone Skp. Proteomics 2008, 8:4987–4994.
Ha SC, Pereira JH, Jeong JH, Huh JH, Kim SH: Purification of human transcription factors Nanog and Sox2, each in complex with Skp, an Escherichia coli periplasmic chaperone. Protein Expr Purif 2009, 67:164–168.
Ritz D, Patel H, Doan B, Zheng M, Aslund F, Storz G, Beckwith J: Thioredoxin 2 is involved in the oxidative stress response in Escherichia coli. J Biol Chem 2000, 275:2505–2512.
Cabiscol E, Tamarit J, Ros J: Oxidative stress in bacteria and protein damage by reactive oxygen species. Int Microbiol 2000, 3:3–8.
Storz G, Tartaglia LA, Ames BN: Transcriptional regulator of oxidative stress-inducible genes: direct activation by oxidation. Science 1990, 248:189–194.
Francis DM, Page R: Strategies to optimize protein expression inE. coli. Curr Protoc Protein Sci 2010. Chapter 5: Unit 5 24 21–29
Pan JL, Sliskovic I, Bardwell JC: Mutants in DsbB that appear to redirect oxidation through the disulfide isomerization pathway. J Mol Biol 2008, 377:1433–1442.
Pioszak AA, Xu HE: Molecular recognition of parathyroid hormone by its G protein-coupled receptor. Proc Natl Acad Sci U S A 2008, 105:5034–5039.
Daegelen P, Studier FW, Lenski RE, Cure S, Kim JF: Tracing ancestors and relatives of Escherichia coli B, and the derivation of B strains REL606 and BL21(DE3). J Mol Biol 2009, 394:634–643.
Studier FW, Moffatt BA: Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. J Mol Biol 1986, 189:113–130.
Jobe A, Bourgeois S: lacRepressor-operator interaction. VI. The natural inducer of the lac operon. J Mol Biol 1972, 69:397–408.
Kudla G, Murray AW, Tollervey D, Plotkin JB: Coding-sequence determinants of gene expression in Escherichia coli. Science 2009, 324:255–258.
Stock JB, Rauch B, Roseman S: Periplasmic space in Salmonella typhimurium and Escherichia coli. J Biol Chem 1977, 252:7850–7861.
Alvarez FA, Georgellis D: In Vitro and In Vivo Analysis of the ArcB/A Redox Signaling Pathway. Methods Enzymol 2010, 471:205–226.
Bekker M, Alexeeva S, Laan W, Sawers G, Teixeira de Mattos J, Hellingwerf K: The ArcBA two-component system of Escherichia coli is regulated by the redox state of both the ubiquinone and the menaquinone pool. J Bacteriol 2010, 192:746–754.
Boyd D, Weiss DS, Chen JC, Beckwith J: Towards single-copy gene expression systems making gene cloning physiologically relevant: lambda InCh, a simple Escherichia coli plasmid-chromosome shuttle system. J Bacteriol 2000, 182:842–847.
Boyd D, Manoil C, Beckwith J: Determinants of membrane protein topology. Proc Natl Acad Sci U S A 1987, 84:8525–8529.
Mössner E, Huber-Wunderlich M, Rietsch A, Beckwith J, Glockshuber R, Aslund F: Importance of redox potential for the in vivo function of the cytoplasmic disulfide reductant thioredoxin from Escherichia coli. J Biol Chem 1999, 274:25254–25259.