Sự liên kết hồi phục của 14-3-3 với glycoprotein Ibα của tiểu cầu điều chỉnh khả năng bám dính, lăn và trải của tế bào trên VWF

Sự bám dính của tiểu cầu đến các vị trí tổn thương mạch máu là điều cần thiết để ngăn chặn chảy máu. Sự bám dính ban đầu của tiểu cầu được trung gian bởi sự liên kết của yếu tố von Willebrand (VWF) với phức hợp glycoprotein (GP) Ib-IX-V, dẫn đến sự kích hoạt của integrin α IIbβ3 và các phân tử khác trung gian cho sự bám dính vững chắc, trải rộng và hình thành cục máu đông. Phức hợp GPIb-IX-V bao gồm 4 polypeptide: GPIbα, GPIbβ, GPIX và GPV, trong tỷ lệ 2:4:2:1. Chỉ ba polypeptide đầu tiên là cần thiết cho chức năng liên kết hoàn chỉnh với VWF. GPIbα là một polypeptide gồm 610 axit amin kết nối mọi ligand phức hợp đã biết trong 300 axit amin N đầu tiên của nó. Miền tế bào chất bao gồm 96 axit amin và chứa các vị trí liên kết cho filamin, PI 3-kinase và protein scaffolding 14-3-3. Sự kết hợp của 14-3-3 với miền tế bào chất của GPIbα điều chỉnh độ ái lực với VWF. Thông thường, 14-3-3 yêu cầu các motif chứa phosphoserine hoặc phosphothreonine để liên kết với các protein mục tiêu. Một trong những motif đó nằm trong miền tế bào chất của GPIbα xung quanh Ser609, nơi bị phosphoryl hóa và được biết đến là liên kết với 14-3-3. Đột biến Ser609 thành Ala sẽ mất đi liên kết với 14-3-3, điều này đã được đề xuất làm giảm khả năng của GPIbα trong việc liên kết với VWF. Sự kết tụ của tiểu cầu dẫn đến sự phân tách của 14-3-3 khỏi một quần thể con của GPIbα. Ser609 cũng bị khử phosphoryl hóa khi tiểu cầu trải rộng. Để phân tích sâu hơn vai trò chức năng của sự liên kết 14-3-3 với GPIbα, chúng tôi đã biểu hiện trong các tế bào buồng trứng chuột Trung Quốc (CHO) các phức hợp GPIb-IX (GPIbα, GPIbβ, và GPIX) chứa GPIbα kiểu hoang dã hoặc các đột biến GPIbα S609A hoặc S609E. Trong các protein khác, việc đột biến Ser thành Glu tại vị trí liên kết 14-3-3 mô phỏng phosphoserine, phục hồi việc liên kết 14-3-3 và thường ngăn chặn sự phân tách 14-3-3. Chúng tôi đã đầu tiên đánh giá khả năng của GPIbα WT và đột biến trong việc liên kết với 14-3-3. Như mong đợi, chúng tôi phát hiện ra rằng GPIbα S609A liên kết rất ít với 14-3-3. GPIbα S609E liên kết với 14-3-3 ở mức độ tương tự như GPIbα WT, cho thấy rằng thay thế Glu có khả năng mô phỏng sự phosphoryl hóa Ser tại dư lượng 609. Sau đó, chúng tôi đã đánh giá khả năng của các tế bào CHO bám dính và lăn trên VWF dưới dòng chảy qua một dải tỷ lệ cắt rộng. Tại 3.26 và 10 dyne/cm2, các tế bào α 609A và α 609E lăn nhanh gấp đôi so với các tế bào WT. Cả tế bào CHO và tiểu cầu đều hiển thị một vận tốc đặc trưng trước sự gia tăng tỷ lệ cắt. Các tế bào α 609A và α 609E cho thấy sự bám dính được tăng cường do cắt giảm; vận tốc chậm nhất của chúng nhanh hơn khoảng 3 lần so với các tế bào WT. Bởi vì GPIbα được khử phosphoryl hóa khi tiểu cầu trải rộng, chúng tôi cũng đã đánh giá ảnh hưởng của các đột biến đến việc trải rộng tế bào trên VWF. Tất cả ba dòng tế bào đều bám dính tương tự VWF nhưng một tỷ lệ cao hơn các tế bào α 609A trải rộng (67% so với 58% cho WT và α 609E). Trong số các tế bào đã trải rộng, các tế bào α S609E trải rộng kém hơn; diện tích trải của chúng ít hơn 15% so với các tế bào WT và α S609A. Hình thái của các tế bào bám dính, trải rộng rất khác nhau giữa các dòng tế bào khác nhau. Các tế bào WT hiển thị một số phần mở rộng filopodia cùng với sự nhuộm phalloidin điểm đặc trưng cho các bám chặt điểm. Trong một số trường hợp, các tế bào đã hiển thị sợi căng thẳng. Các tế bào α S609A mở rộng nhiều hơn và dài hơn filopodia so với các tế bào WT nhưng có ít bám dính điểm hơn và nhiều sợi căng thẳng hơn. Các tế bào CHO α S609E đã mở rộng filopodia mảnh nhưng có xu hướng phân cực ở hai bên cơ thể tế bào, và có ít bám dính điểm và không có sợi căng thẳng. Chúng tôi cũng đã xem xét ảnh hưởng của các đột biến đến việc tập trung phức hợp GPIb-IX vào các microdomain màng lipid raft, điều này là cần thiết cho sự bám dính của tiểu cầu vào VWF. Raft GPIbα giảm 40% ở các tế bào S609A nhưng tăng 1.6 lần ở các tế bào S609E. Tóm lại, việc thiếu sự liên kết 14-3-3 đã giảm độ tập trung của phức hợp trong raft, giảm sự bám dính tế bào do cắt nhưng lại tăng cường trải rộng tế bào. Sự liên kết 14-3-3 ổn định làm tăng độ tập trung trong raft, nhưng làm giảm sự bám dính tế bào do cắt và giảm khả năng trải rộng hoàn toàn của tế bào. Kết hợp lại, các kết quả của chúng tôi chứng tỏ rằng sự điều chỉnh của sự liên kết 14-3-3 do trạng thái phosphoryl hóa của S609 là cần thiết cho sự bám dính phối hợp và trải rộng tế bào. Tổng hợp lại, các kết quả của chúng tôi chứng tỏ rằng các chức năng của phức hợp GPIb-IX được điều chỉnh bởi khả năng của GPIbα Ser609 vừa có thể liên kết vừa có thể giải phóng 14-3-3 và gợi ý rằng không phải chỉ có sự liên kết với 14-3-3 mà là điều chỉnh chức năng của GPIbα.