S. Humblet-Baron1,2, W. Zhang1,2, K. Kipp1, S. Khim1, J. Jarjour1, K. Sommer1, D.J. Rawlings1
1Pediatrics and Immunology, UW and CHMRC, Seattle, WA
2Equal Contribution to This Work
Tóm tắt
Tóm tắt
Bệnh thiếu gamma globulin liên kết X (XLA) là một dạng suy giảm miễn dịch ở người do đột biến trong kinase tyrosine Bruton (Btk), được đặc trưng bởi sự ngưng trệ trong quá trình phát triển tế bào B sớm, không có immunoglobulin huyết thanh và sự nhiễm trùng vi khuẩn tái phát. Sử dụng chuột thiếu hụt kép Btk và Tec (Btk/Tec−/ −) làm mô hình cho XLA, chúng tôi đã chỉ ra rằng việc chuyển giao gen Btk bằng virus retrovirus trênco đã hồi phục sự phát triển và chức năng tế bào B phụ thuộc Btk trong cơ thể (Yu et al. Blood 104(5):1281–90).
Để tăng cường độ an toàn cho phương pháp này, chúng tôi đã phát triển một vector lentivirus SIN với yếu tố tăng cường/khởi động đặc hiệu cho tế bào B, Eμ B29. Sử dụng các vector lentivirus SIN biểu hiện GFP, chúng tôi nhận thấy Eμ B29 nhất quán thúc đẩy sự biểu hiện GFP cao gấp 3–5 lần trong các tế bào B dòng người được thu nhận từ tế bào gốc tạo huyết (HSC) trong thí nghiệm ống nghiệm và trong mô hình in vivo (ASGT 2002 tóm tắt #1302). Chúng tôi cũng đã đánh giá vector này, CSOM-Eμ B29-GFP-WPRE, trong chuột transgenic lentivirus, nơi nó thể hiện biểu hiện GFP cao nhất trong các tế bào B ngoại vi so với tất cả các dòng tế bào huyết học khác. Cụ thể, trong hơn 8 giống khởi đầu độc lập, MFI cho biểu hiện GFP trong tế bào B cao hơn gấp >3 lần so với tế bào T (p=0.0002).
Dựa trên các phát hiện này, chúng tôi đã phát triển các vector lentivirus SIN Eμ B29-huBtk với hoặc không có yếu tố cách ly do chất cách ly β-globulin gà (HS4) tạo ra. Sử dụng cả hai vector để chuyển giao vào tế bào Btk−/− DT40, và sau đó nhân bản bằng phương pháp pha loãng giới hạn, chúng tôi đã chứng minh sự biểu hiện protein Btk qua nhuộm tế bào nội bào và phương pháp western blotting, và phục hồi hoàn toàn tín hiệu Ca2+ trung gian tế bào B receptor (BCR) phụ thuộc Btk trong tất cả các dòng tế bào được đánh giá, bao gồm cả các dòng tế bào thể hiện tích hợp virus đơn. Tiếp theo, chúng tôi đã thử nghiệm khả năng của các vector này để tái lập sự phát triển và chức năng tế bào B phụ thuộc Btk trong một nhóm chuột Btk/Tec−/−. Tủy xương từ chuột Btk/Tec −/− được điều trị bằng 5-FU đã được thu hoạch, nuôi cấy trên đĩa phủ fibronectin với các yếu tố tăng trưởng (mIL-3, mIL-6, mSCF, mTPO và mFLT3ligand) và virus lentivirus được tập trung (2.3x107 pg/106 tế bào được đo bằng mức p24).
Sau 48h nuôi cấy in vitro, các tế bào được cấy vào động vật đã bị chiếu xạ gây chết và các động vật được cấy được đánh giá liên tục về sự hiện diện của tế bào B trong máu ngoại vi. Số lượng tế bào B tăng dần một cách đáng kể, chỉ sau 6 tuần ở những chuột nhận tủy đã chuyển giao (16–18% tế bào B220+) so với tủy kiểm soát (8–9%; không chuyển giao gì). Hơn nữa, tế bào B trưởng thành (B220+IgMlowIgDhi) chiếm 14–20% tổng số tế bào B trong nhóm được điều trị so với <5% trong nhóm kiểm soát. Cuối cùng, những chú chuột nhận tế bào đã chuyển giao cho thấy sự phục hồi mức IgM và IgG3 huyết thanh và phản ứng với tiêm chủng phụ thuộc TI-II. Kết quả từ hai nhóm động vật bổ sung nữa sẽ được trình bày. Tóm lại, dữ liệu của chúng tôi cho thấy rằng vector lentivirus SIN Eμ B29-Btk thúc đẩy một cách cụ thể sự biểu hiện Btk trong các tế bào dòng B và sửa chữa kiểu hình thiếu Btk in vitro và in vivo.
Các tế bào B trong máu ngoại vi đã được phân tích sự biểu hiện IgM và IgD tương đối sau 6 tuần kể từ khi tái lập. Dữ liệu đại diện từ các động vật nhận tủy không chuyển giao so với tủy được chuyển giao EμB29-Btk được trình bày. Phần tư trên bên trái cho thấy phần trăm của tế bào B trưởng thành đang lưu hành. Các tế bào B trong máu ngoại vi đã được phân tích sự biểu hiện IgM và IgD tương đối sau 6 tuần kể từ khi tái lập. Dữ liệu đại diện từ các động vật nhận tủy không chuyển giao so với tủy được chuyển giao EμB29-Btk được trình bày. Phần tư trên bên trái cho thấy phần trăm của tế bào B trưởng thành đang lưu hành.
