Hoạt động và điều hòa của gen CYP4B1 trên giác mạc do thiếu oxy
Tóm tắt
Tổn thương do thiếu oxy trên bề mặt mắt gây ra phản ứng viêm, một phần được điều hòa bởi 12-hydroxyeicosanoids do biểu mô giác mạc sản sinh. Các nghiên cứu gần đây chỉ ra rằng một cytochrome P450 (CYP) monooxygenase, được xác định là CYP4B1, liên quan đến việc sản xuất các eicosanoids này, vốn có những đặc tính viêm và tạo mạch mạnh mẽ. Chúng tôi đã phân lập và nhân bản cDNA đầy đủ chiều dài của CYP4B1 từ biểu mô giác mạc và chứng minh rằng mRNA CYP4B1 được kích thích bởi tình trạng thiếu oxy trong ống nghiệm cũng như trong cơ thể sống. Để hiểu rõ hơn về việc điều hòa phân tử mà điều này phụ thuộc vào việc tổng hợp các eicosanoids viêm mạnh này trong phản ứng với tổn thương do thiếu oxy, chúng tôi đã phân lập và nhân bản vùng điều khiển (promoter) của CYP4B1. Thư viện GenomeWalker được xây dựng từ ADN gen biểu mô giác mạc thỏ đã được sử dụng làm mẫu cho các phản ứng PCR ban đầu và lồng ghép với các mồi đặc hiệu cho gen và mồi nối. Một đoạn ADN 3.41-kb từ vùng 5'-flanking của promoter CYP4B1 đã được phân lập, nhân bản, giải trình tự và phân tích bằng phần mềm máy tính để tìm kiếm sự tồn tại của các yếu tố hành động cis đã biết. Phân tích trình tự promoter cho thấy sự hiện diện của các chuỗi liên kết ADN đồng thuận cho các yếu tố được biết đến là tác nhân kích thích phiên mã gen trong điều kiện thiếu oxy, bao gồm HIF-1, NFκB và AP-1. Việc chuyển gen tạm thời các vector báo cáo luciferase (pGL3-Basic) chứa các độ dài khác nhau của đoạn promoter CYP4B1 đã chứng minh sự phiên mã được kích thích bởi thiếu oxy trong các tế bào biểu mô giác mạc thỏ (RCE). Thử nghiệm di chuyển điện thoại điện (EMSA) tiết lộ sự tăng cường rõ rệt hoạt động liên kết hạt nhân cho đầu dò HIF-1 đánh dấu từ promoter CYP4B1 trong các chiết xuất hạt nhân của các tế bào tiếp xúc với thiếu oxy. Hoạt động liên kết này là do sự liên kết chuỗi đặc hiệu với đầu dò oligonucleotide HIF-1 như đã chỉ ra bởi sự cạnh tranh với đầu dò chưa đánh dấu dư thừa cho HIF-1 nhưng không phải với đầu dò NFκB chưa đánh dấu. Hoạt động liên kết hạt nhân của các đầu dò AP-1 và NFκB từ promoter CYP4B1 cũng được tăng cường trong phản ứng với tình trạng thiếu oxy, cho thấy rằng các yếu tố phiên mã này góp phần vào sự kích thích thiếu oxy của biểu hiện CYP4B1. Kết quả của nghiên cứu này cung cấp lời giải thích cơ chế phân tử đầu tiên cho sự kích thích CYP4B1 và, do đó, sự sản xuất các eicosanoids viêm trong phản ứng với tổn thương do thiếu oxy. Cần có thêm các nghiên cứu để đánh giá đầy đủ việc điều hòa phân tử của gen này trong quá trình viêm. © 2004 Wiley‐Liss, Inc.
Từ khóa
Tài liệu tham khảo
Araki K, 1993, Immortalization of rabbit corneal epithelial cells by a recombinant SV40‐adenovirus vector, Invest Ophthalmol Vis Sci, 34, 2665
Bae SK, 1999, Egr‐1 mediates transcriptional activation of IGF‐II gene in response to hypoxia, Cancer Res, 59, 5989
Conners MS, 1995, A closed eye‐contact lens model of corneal inflammation. II. Inhibition of cytochrome P450 arachidonic acid metabolism alleviates inflammatory sequelae, Invest Ophthalmol Vis Sci, 36, 841
Conners MS, 1995, A closed eye‐contact lens model of corneal inflammation. I. Induction of cytochrome P450 arachidonic acid metabolism, Invest Ophthalmol Vis Sci, 36, 828
Conners MS, 1997, Alkali burn‐induced synthesis of inflammatory eicosanoids in rabbit corneal epithelium, Invest Ophthalmol Vis Sci, 38, 1963
Gasser R, 1989, Primary structures of cytochrome P‐450 isozyme 5 from rabbit and rat and regulation of species‐dependent expression and induction in lung and liver: Identification of cytochrome P‐450 gene subfamily IVB, Mol Pharmacol, 35, 617
Green CJ, 2001, Placenta growth factor gene expression is induced by hypoxia in fibroblasts: A central role for metal transcription factor‐1, Cancer Res, 61, 2696
Koong AC, 1994, Hypoxia causes the activation of nuclear factor κB through the phosphorylation of IkB on tyrosine residues, Can Res, 54, 1425
Mastyugin V, 1999, Hypoxia‐induced production of 12‐hydroxyeicosanoids in the corneal epithelium: Involvement of a CYP4B1 isoform, J Pharmacol Exp Ther, 289, 1611
Mazure NM, 2002, Repression of alpha‐fetoprotein gene expression under hypoxic conditions in human hepatoma cells: Characterization of a negative hypoxia response element that mediates opposite effects of hypoxia inducible factor‐1 and c‐Myc, Cancer Res, 62, 1158
Mieyal PA, 2001, Detection of endogenous 12‐hydroxyeicosatrienoic acid in human tear film, Invest Ophthalmol, 42, 328
Park H, 1999, Aromatic hydrocarbon nuclear translocator as a common component for the hypoxia‐ and dioxin‐induced gene expression, Mol Cells, 9, 172, 10.1016/S1016-8478(23)13526-6
Sack RA, 1992, Diurnal tear cycle: Evidence of a nocturnal inflammatory constitutive tear fluid, Invest Ophthalmol Vis Sci, 33, 626
Vafeas C, 1998, Hypoxia stimulates the synthesis of cytochrome P450‐derived inflammatory eicosanoids in rabbit corneal epithelium, J Pharmacol Exp Ther, 287, 903