Bình Thường Hoá Dữ Liệu PCR Sao Chép Ngược Định Lượng Thời Gian Thực: Cách Tiếp Cận Ước Tính Biến Động Dựa Trên Mô Hình Để Xác Định Các Gene Thích Hợp Cho Bình Thường Hoá, Áp Dụng Cho Các Bộ Dữ Liệu Ung Thư Bàng Quang và Ruột Kết
Tóm tắt
Bình thường hóa chính xác là điều kiện tiên quyết tuyệt đối để đo lường đúng biểu hiện gene. Đối với PCR sao chép ngược định lượng thời gian thực (RT-PCR), chiến lược bình thường hóa phổ biến nhất bao gồm tiêu chuẩn hóa một gene kiểm soát được biểu hiện liên tục. Tuy nhiên, trong những năm gần đây, đã trở nên rõ ràng rằng không có gene nào được biểu hiện liên tục ở tất cả các loại tế bào và dưới mọi điều kiện thí nghiệm, ngụ ý rằng sự ổn định biểu hiện của gene kiểm soát dự kiến phải được xác minh trước mỗi thí nghiệm. Chúng tôi đã trình bày một chiến lược mới, sáng tạo và mạnh mẽ để xác định các gene được biểu hiện ổn định trong một tập hợp các gene ứng cử viên để bình thường hóa. Chiến lược này bắt nguồn từ một mô hình toán học về biểu hiện gene cho phép ước lượng không chỉ sự biến đổi tổng thể của các gene nghị biểu bình thường mà còn sự biến đổi giữa các nhóm mẫu bộ của tập hợp mẫu. Đáng chú ý, chiến lược này cung cấp một thước đo trực tiếp cho sự biến đổi biểu hiện ước tính, cho phép người dùng đánh giá lỗi hệ thống được tạo ra khi sử dụng gene này. Trong một so sánh trực tiếp với một chiến lược đã được công bố trước đó, cách tiếp cận dựa trên mô hình của chúng tôi có hiệu suất mạnh mẽ hơn và ít nhạy cảm hơn đối với điều chỉnh đồng biến của các gene bình thường hóa ứng cử viên. Chúng tôi đã sử dụng chiến lược dựa trên mô hình để xác định các gene phù hợp để bình thường hóa dữ liệu RT-PCR định lượng từ ung thư ruột kết và ung thư bàng quang. Các gene này bao gồm UBC, GAPD, và TPT1 cho ruột kết và HSPCB, TEGT, và ATP5B cho bàng quang. Chiến lược được trình bày có thể được áp dụng để đánh giá độ thích hợp của bất kỳ ứng cử viên gene bình thường hóa trong bất kỳ loại thiết kế thí nghiệm nào và nên cho phép bình thường hóa dữ liệu RT-PCR đáng tin cậy hơn.
Từ khóa
#PCR #Sao chép ngược #Biểu hiện gene #Bình thường hóa #Phương pháp dựa trên mô hình #Ung thư ruột kết #Ung thư bàng quang #Biến đổi biểu hiện #Gene kiểm soát #Ứng cử viên bình thường hóa.Tài liệu tham khảo
Bustin SA Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays. J Mol Endocrinol, 25: 169-93, 2000.
Bustin SA Quantification of mRNA using real-time reverse transcription PCR (RT-PCR): trends and problems. J Mol Endocrinol, 29: 23-39, 2002.
Schmittgen TD, Zakrajsek BA Effect of experimental treatment on housekeeping gene expression: validation by real-time, quantitative RT-PCR. J Biochem Biophys Methods, 46: 69-81, 2000.
Suzuki T, Higgins PJ, Crawford DR Control selection for RNA quantitation. Biotechniques, 29: 332-7, 2000.
Thellin O, Zorzi W, Lakaye B, et al Housekeeping genes as internal standards: use and limits. J Biotechnol, 75: 291-5, 1999.
Tricarico C, Pinzani P, Bianchi S, et al Quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction: normalization to rRNA or single housekeeping genes is inappropriate for human tissue biopsies. Anal Biochem, 309: 293-300, 2002.
Warrington JA, Nair A, Mahadevappa M, Tsyganskaya M Comparison of human adult and fetal expression and identification of 535 housekeeping/maintenance genes. Physiol Genomics, 2: 143-7, 2000.
Vandesompele J, De Preter K, Pattyn F, et al Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes. Genome Biol, 3: RESEARCH0034 2002.
Dyrskjot L, Thykjaer T, Kruhoffer M, et al Identifying distinct classes of bladder carcinoma using microarrays. Nat Genet, 33: 90-6, 2003.
Frederiksen CM, Knudsen S, Laurberg S, Orntoft TF Classification of Dukes’ B and C colorectal cancers using expression arrays. J Cancer Res Clin Oncol, 129: 263-71, 2003.
Bolstad BM, Irizarry RA, Astrand M, Speed TP A comparison of normalization methods for high density oligonucleotide array data based on variance and bias. Bioinformatics, 19: 185-93, 2003.
Irizarry RA, Bolstad BM, Collin F, et al Summaries of Affymetrix GeneChip probe level data. Nucleic Acids Res, 31: e15 2003.
Livak KJ, Schmittgen TD Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(−Delta Delta C(T)) method. Methods, 25: 402-8, 2001.
Kent WJ BLAT: the BLAST-like alignment tool. Genome Res, 12: 656-64, 2002.