Paola Neri1, Ranjan Maity1, Jean-Baptiste Alberge2, Sarthak Sinha1, Justin Donovan1, Madison Kong1, Fajer Hasan1, Arzina Jaffer1, Lawrence H. Boise3, Nizar Bahlis1
1Arnie Charbonneau Cancer Research Institute, University of Calgary, Calgary, Canada
2CRCINA, INSERM, CNRS, Universite de Nantes, Nantes, France
3Winship Cancer Institute, Department of Hematology and Medical Oncology, Emory University, Atlanta, GA
Tóm tắt
Ch背景: Việc ức chế chọn lọc BCL2 bằng venetoclax dẫn đến những phản ứng mạnh mẽ ở những bệnh nhân U tủy tái phát. Tuy nhiên, sự kháng thuốc phát sinh đối với venetoclax thường xuyên xảy ra. Đáng chú ý, trong thử nghiệm Bellini, trong khi sự kết hợp giữa venetoclax và bortezomib đã làm tăng gấp đôi thời gian sống không bệnh (progression-free survival) so với nhóm chứng, nó lại dẫn đến thời gian sống tổng quát ngắn hơn. Những kết quả này làm nổi bật những thách thức mà sự kháng thuốc thứ phát đặt ra và sự cần thiết phải điều tra các cơ chế trung gian cho sự phát sinh kháng thuốc đối với venetoclax.
Phương pháp & Kết quả: Các mẫu tủy xương (BM) được thu thập từ bệnh nhân (n=8) điều trị bằng venetoclax trước khi bắt đầu liệu pháp và tại thời điểm tiến triển bệnh. Các phân đoạn tế bào đơn nhân đã được tách ra qua ficoll kết hợp với việc phân loại từ tính các tế bào CD138+. Phân tích chức năng ex-vivo về độ nhạy cảm với venetoclax đã được thực hiện trên các tế bào CD138+. Việc phân tích mRNA và DNA không thiên lệch đã được thực hiện thông qua việc giải trình tự RNA đơn tế bào (scRNA-seq), scATAC-seq và phân tích số bản sao của tế bào đơn (scCNV) sử dụng hệ thống GemCode (10x Genomics). Cell Ranger, Seurat, Signac và Monocle đã được sử dụng để phân tích dữ liệu. Các nghiên cứu apoptosis ex-vivo tiết lộ sự thay đổi động của IC50 của venetoclax từ trung vị 100 nM ở mẫu trước điều trị đến >1000 nM tại thời điểm tiến triển bệnh. Phân tích CNV của tế bào đơn xác định sự mở rộng đáng kể của một cụm tế bào tiền điều trị với số bản sao 1q21 gia tăng (<1%) trở thành clone chiếm ưu thế (>70%) tại thời điểm tái phát. Quy mô của sự gia tăng 1q CNV dao động từ 3 Mb đến mức gia tăng rất riêng biệt 100 kb bao gồm locus gen MCL1. Đáng chú ý, sự gia tăng số bản sao cũng được xác định trong gen BCL2L1, nhưng không phát hiện sự mất số bản sao ở các locus gen BAX hoặc BAK. Phân tích RNA tế bào đơn của các mẫu tương tự xác nhận sự gia tăng trong chuỗi mRNA MCL1 với sự giảm điều chỉnh của BCL2 tại thời điểm tái phát. Nhất quán với mô hình tiến hóa tách nhánh, scATAC-seq đã tiết lộ các nghiên cứu về khả năng tiếp cận chromatin tăng lên tại locus MCL1 trong các cụm tế bào của các mẫu tái phát. Phân tích quỹ đạo tế bào và sắp xếp thời gian giả của các tế bào (Monocle) tiết lộ sự xuất hiện của một clone phân chia cao và một clone phụ thuộc vào MCL1 khi bệnh tiến triển từ cụm phụ thuộc vào BCL2 ban đầu ở thời gian giả (t0) (Hình). Hơn nữa, phân tích apoptosis ex-vivo đã tiết lộ sự chuyển đổi độ nhạy cảm của các tế bào CD138+ với độ nhạy cảm acquired đối với chất ức chế MCL1 (S63845). Những phát hiện này cho thấy rằng sự gia tăng số bản sao 1q21 với sự tăng cường MCL1 có khả năng trung gian cho sự kháng venetoclax đã được phát sinh. Để xác nhận chức năng liệu sự gia tăng MCL1 có đủ để thay đổi từ BCL2 sang phụ thuộc vào MCL1 và gây ra kháng với venetoclax không, chúng tôi đã biểu hiện ổn định MCL1 trong dòng tế bào MM phụ thuộc BCL2 KMS12PE (KMS12PE_MCL1) và kiểm tra độ nhạy của nó với venetoclax và/hoặc S63845 so với vector kiểm soát (KMS12PE_EV). Đáng chú ý, co-immunoprecipitation (co-IP) của BIM trong KMS12PE_MCL1 chứng minh sự chuyển đổi trong việc tải BIM và co-IP với MCL1 và BCL2 trong khi điều này bị hạn chế ở BCL2 trong các tế bào KMS12PE_EV. Quan trọng, IC50 venetoclax của KMS12PE_EV tăng 200 lần trong các tế bào KMS12PE_MCL1 với độ nhạy cảm acquired đối với S63845. Phân tích scCNV của một bệnh nhân không xác định bất kỳ sự gia tăng nào ở locus 1q trong thời gian tiến triển bệnh đối với venetoclax. Tuy nhiên, phân tích đột biến xác định một đột biến BCL2 de novo [NM_000633.2:c.332A>C, p.(Asp111Ala)]. Để xác định liệu đột biến Asp111Ala có đủ để gây ra kháng với venetoclax không, đột biến này đã được biểu hiện quá mức trong các tế bào KMS12PE. Trong khi sự gắn kết của BIM với BCL2 không bị ảnh hưởng, Asp111Ala đã phần lớn làm cản trở sự chuyển dịch BIM gây ra bởi venetoclax ra khỏi BCL2 và làm giảm độ nhạy của tế bào KMS12PE đối với venetoclax khoảng 7,5 lần. Mô hình cấu trúc cũng chứng minh sự không thể của venetoclax trong việc gắn kết chặt chẽ với rãnh kỵ nước của BCL2_Asp111Ala đã đột biến.
Kết luận: Chúng tôi đã phát hiện và đặc trưng hóa chức năng một đột biến BCL2 mới có khả năng gây ra sự kháng in vitro và in vivo với bệnh nhân MM được điều trị bằng venetoclax. Ngoài ra, chúng tôi đã xác định thông qua phân tích tế bào đơn có sự làm giàu của các clone MM với số bản sao locus MCL1 gia tăng vào thời điểm bị kháng venetoclax. Việc phát hiện sớm và giám sát động học những bất thường này (đột biến BCL2 hoặc gia tăng 1q) với những can thiệp điều trị sớm nhằm mục tiêu vào các clone này có thể tăng cường hiệu quả venetoclax và cải thiện sự sống sót của bệnh nhân.
