Maddalena Noviello1, Francesco Manfredi1, Tommaso Perini2, Giacomo Oliveira1, Filippo Cortesi3, Cristina Toffalori4, Valentina Gambacorta4, Attilio Bondanza5, Raffaella Greco2, Jacopo Peccatori2, Giulia Casorati3, Paolo Dellabona3, Nicoletta Cieri6, Luca Vago4, Fabio Ciceri2, Chiara Bonini1
1Experimental Hematology Unit, IRCCS San Raffaele Scientific Institute, Milan, Italy
2Hematology and Bone Marrow Transplantation Unit, IRCCS San Raffaele Scientific Institute, Milan, Italy
3Experimental Immunology Unit, IRCCS San Raffaele Scientific Institute, Milan, Italy
4Unit of Immunogenetics, Leukemia Genomics and Immunobiology, IRCCS San Raffaele Scientific Institute, Milan, Italy
5Innovative Immunotherapies Unit, IRCCS San Raffaele Scientific Institute, Milan, Italy
6University of Milano, Milan, Italy
Tóm tắt
Tóm tắt
Nền tảng: Ghép tế bào gốc huyết học đồng loại (HSCT) là phương pháp điều trị duy nhất cho bệnh bạch cầu dòng tủy cấp tính (AML) nguy cơ cao. Thật không may, tái phát vẫn là nguyên nhân chính gây tử vong sau HSCT. Chúng tôi đã điều tra xem sự suy giảm chức năng tế bào T có liên quan đến tái phát sau ghép hay không.
Bệnh nhân và phương pháp: Để làm điều này, chúng tôi đã phân tích động lực học tế bào T theo chiều dọc trong tủy xương (BM) và máu ngoại vi (PB) của 32 bệnh nhân AML được nhận HSCT từ người cho đồng HLA (HLAid, 20 bệnh nhân) hoặc đồng HLA haplo (haplo, 12 bệnh nhân). Các mẫu đã được phân tích bằng phương pháp phân tích tế bào dòng đa thông số để điều tra sự biểu hiện của các thụ thể ức chế (IR) trên các phân nhóm tế bào T CD4 và CD8 được xác định bởi sự biểu hiện của CD45RA, CD62L và CD95, và để đánh giá tỷ lệ của các tế bào T điều hòa (Tregs; CD4+CD25+FoxP3+). Kết quả cũng được phân tích bằng thuật toán BH-SNE, một phương pháp tính toán không thiên vị cho phân tích dữ liệu FACS. Để đánh giá chức năng của tế bào T, xét nghiệm degranulation CD107a đã được thực hiện và sự sản xuất cytokine (IL-2, IFNg và TNFa) được đo bằng cách nhuộm tế bào nội bào. BM và PB đã được thu thập 60 ngày sau HSCT và tại thời điểm tái phát (trung bình 237 ngày; 16 bệnh nhân) hoặc, khi đạt được remision hoàn toàn (CR; 16 bệnh nhân), tại 1 năm. Các mẫu từ 8 người hiến tặng khỏe mạnh (HD) được sử dụng làm đối chứng.
Kết quả: Sau ghép, tế bào T BM và PB cho thấy tỷ lệ CD4/CD8 thấp hơn (p<0.01) và một hồ sơ phân hóa muộn ưu thế (p<0.05) so với HD. Một tỷ lệ cao hơn của Tregs BM đã được ghi nhận tại thời điểm tái phát (p<0.01), một cách độc lập với nguồn gốc người cho.
Chúng tôi đã điều tra sự biểu hiện của một số IR như là những dấu hiệu của sự suy kiệt tế bào T. Sau haplo-HSCT, PD-1, CTLA-4, 2B4 và Tim-3 đã được điều chỉnh đáng kể trong tế bào T BM và PB ở tất cả thời điểm, so với HD và độc lập với kết quả lâm sàng. Ngược lại, sau HLAid-HSCT, tại thời điểm muộn, các bệnh nhân tái phát cho thấy tần suất cao hơn của tế bào T xâm nhập vào BM biểu hiện PD-1, CTLA-4 và Tim-3 so với các bệnh nhân CR (p<0.05) và HD (p<0.01). Sau đó, chúng tôi đã điều tra hồ sơ của từng phân nhóm tế bào T trong nhóm nghiên cứu của chúng tôi. Trong BM của HD, sự biểu hiện IR chỉ giới hạn ở tế bào ghi nhớ hiệu quả và tế bào hiệu quả. Trong khi sự phân bố IR tương tự được quan sát thấy trong CR, tại thời điểm tái phát, PD-1, 2B4 và Tim-3 cũng đã được điều chỉnh trong các tế bào T ghi nhớ trung tâm (p<0.01) và các tế bào T gốc ghi nhớ (p<0.05). Thú vị là, tại thời điểm tái phát, bệnh bạch cầu biểu hiện PD-L1 (9/9 trường hợp) và Galectin-9 (6/9). Mức Tim-3 trên tế bào CD8 BM liên quan đến mức Galectin-9 trên các tế bào bốc tự (p<0.05), cho thấy vai trò ưu tiên của trục điều hòa miễn dịch này sau HSCT. Dựa trên những điểm tương đồng về kiểu hình, thuật toán BH-SNE đã định vị các mẫu HD tách biệt so với bệnh nhân đã ghép trong các bản đồ hai chiều. 93 cụm quan trọng đã được xác định. Các cụm liên quan đến tái phát sau HLA-id (5) và sau haplo (15) gồm các tế bào T biểu hiện nhiều IR, trong khi các cụm đặc hiệu cho CR đã giảm trong độ huỳnh quang IR.
Để xác minh xem hồ sơ kiểu hình suy kiệt tế bào T tại tái phát có liên quan đến sự suy giảm chức năng hay không, chúng tôi đã đánh giá các chức năng hiệu quả của tế bào T sau khi kích thích đa dòng. Đáng chú ý, chúng tôi đã quan sát thấy khả năng degranulation thấp hơn của các tế bào CD8 tại tái phát so với CR (p<0.05). Trong hai bệnh nhân, được chọn dựa trên sự sẵn có của các mẫu, chúng tôi đã phân lập và mở rộng bằng cách sử dụng giao thức mở rộng nhanh (REP) tế bào T biểu hiện một hoặc nhiều IR (IR+) hoặc không có IR (IR-). Tỷ lệ mở rộng là cao và giống nhau ở tế bào IR+ và IR- (tăng trung bình 624 và 781, tương ứng tại ngày 21). Khả năng degranulation được đo ngoài cơ thể ở những bệnh nhân đó (trung bình 4.4% trên tế bào CD8) đã tăng lên đáng kể sau khi mở rộng REP (95% và 88.9% cho IR+ và IR-, tương ứng). Tương tự, tần suất tế bào CD8 sản xuất IFN-g đã tăng trong các tế bào IR+ và IR- sau REP, cho thấy rằng sự suy chức năng tế bào T quan sát được tại tái phát có thể được đảo ngược một cách hiệu quả. Tiếp theo, chúng tôi đã thách thức các tế bào IR+ và IR- chống lại các tế bào bốc tự. Kết quả sơ bộ cho thấy rằng các tế bào T IR+ được làm giàu với đặc hiệu với bệnh bạch cầu (chỉ số loại bỏ là 66% và 44% trong tế bào IR+ và IR-, tương ứng tại tỷ lệ E/T là 100:1).
Kết luận: Sau HSCT, dấu hiệu phân tử của các tế bào CD8 bị kiệt sức ở các bệnh nhân tái phát bao gồm PD-1, CTLA-4, 2B4 và Tim-3. Sự biểu hiện của các IR trên các tế bào T tiền phân hóa trung tâm và tế bào T gốc ghi nhớ tại thời điểm tái phát cho thấy một sự suy giảm miễn dịch rộng rãi, mặc dù có thể đảo ngược, do các tế bào bạch cầu tái phát gây ra.
Các công bố
Bondanza: TxCell: Tài trợ nghiên cứu; MolMed SpA: Tài trợ nghiên cứu; Formula Pharmaceuticals: Thù lao. Ciceri: MolMed SpA: Tư vấn. Bonini: TxCell: Thành viên trong Hội đồng Quản trị hoặc ủy ban tư vấn của một thực thể; MolMed SpA: Tư vấn.
