Kỹ thuật nhuộm phospho-protein nội bào cho dòng tế bào: Giám sát các sự kiện tín hiệu tế bào đơn lẻ

Những tiến bộ gần đây trong kỹ thuật nhuộm nội bào, công nghệ đo tế bào, thuốc nhuộm huỳnh quang, và sản xuất kháng thể đã mở rộng số lượng kháng nguyên nội bào có thể phân tích bằng phương pháp đo dòng tế bào. Việc đo lường phosphoryl hoá protein với kháng thể đặc hiệu phospho đã mang lại cái nhìn sâu sắc về các chuỗi tín hiệu kinase. Tuy nhiên, những kỹ thuật hiện có về nhuộm phospho-epitope có thể khác nhau nhiều, khiến việc hiểu rõ sự khác biệt giữa các kết quả ứng dụng các kỹ thuật này và phát triển các phương pháp ứng dụng bền vững, có thể tái lập là cần thiết.

Mười kỹ thuật cố định tế bào và làm cho tế bào thẩm thấu khác nhau đã được kiểm tra về khả năng cung cấp nhuộm đặc hiệu phospho. Các tổ hợp formaldehyde, methanol, ethanol, acetone, Triton X-100, và saponin được sử dụng như các chất cố định và thẩm thấu. Các kháng thể đặc hiệu phospho được gắn thuốc nhuộm Alexa Fluor để cung cấp phân tích đa sắc màu của các sự kiện tín hiệu khác nhau đồng thời trong từng tế bào.

Cố định tế bào với 1,5% formaldehyde sau đó làm thẩm thấu trong methanol đã cho kết quả tối ưu cho nhuộm pERK, pp38, pJNK, pStat1, pStat5, và pStat6. Thay đổi thời gian cố định formaldehyde và thẩm thấu methanol làm ảnh hưởng đến đo lường sự kích hoạt phosphoryl hoá. Phân tích đo dòng tế bào đặc hiệu phospho có sự tương quan tốt với phương pháp Western blotting, cung cấp sự xác thực nền tảng chéo cho kỹ thuật này.

Việc đo sự kiện phosphoryl hoá bằng phương pháp đo dòng tế bào cung cấp một cách nhanh chóng và hiệu quả để đo chuỗi kinase trong từng tế bào. Sự ổn định của phospho-epitope trong methanol cho phép lưu trữ lâu dài các mẫu trước khi phân tích. Nhiều chuỗi tín hiệu có thể được giám sát đồng thời thông qua việc sử dụng các nhãn thuốc nhuộm huỳnh quang khác nhau để xác định sự đặc hiệu của các ligand hoặc chất ức chế. Áp dụng các kỹ thuật được tối ưu hóa cho các loại tế bào không đồng nhất như máu ngoại vi hoặc tế bào lách chuột có thể cho phép phân tích tín hiệu đồng thời trong các tập hợp tế bào miễn dịch. Cytometry Part A 55A:61–70, 2003. © 2003 Wiley-Liss, Inc.