Nội dung được dịch bởi AI, chỉ mang tính chất tham khảo
Cải thiện thiết kế và tạo ra các dòng knockdown cây trồng đặc hiệu cao bằng cách sử dụng microRNA tổng hợp sơ cấp (pri-smiRNA)
Tóm tắt
microRNAs (miRNAs) là các RNA nhỏ không mã hóa nội sinh có chức năng điều chỉnh biểu hiện gene sau phiên mã. Ở thực vật, chúng thường thể hiện tính bổ sung cao với một motif chuỗi duy nhất trong các mRNA mục tiêu và hoạt động bằng cách xúc tác quá trình cắt đứt và phân hủy mRNA cụ thể. miRNAs được xử lý từ các bản sao chính dài hơn thông qua các precursor miRNAs có cấu trúc gập lại. Giữ nguyên những cấu trúc thứ cấp này, miRNAs có thể được thiết kế lại một cách thực nghiệm để nhắm đến các mRNA theo ý muốn. Chúng tôi đã thiết kế các miRNAs tổng hợp sơ cấp (pri-smiRNAs) dựa trên bản sao chính của gene Arabidopsis MIR159A bằng cách thay thế miR159a gốc và miR159a* tương ứng bằng các chuỗi mới, giữ nguyên cấu trúc thứ cấp tổng thể như đã dự đoán bởi chương trình RNAfold. Chúng tôi đã sử dụng chương trình RNAhybrid để tối ưu hóa thiết kế smiRNA và để sàng lọc toàn bộ bộ gen Arabidopsis nhằm tìm kiếm các mục tiêu ngoài ý muốn. Để cải thiện việc nhân bản phân tử của pri-smiRNA, chúng tôi đã chèn các vị trí cắt hạn chế vào bản sao chính MIR159A ban đầu để dễ dàng chứa được mảnh DNA smiRNA/smiRNA*. Như một thử nghiệm minh chứng, chúng tôi đã nhắm đến gene duy nhất mã hóa chalcone synthase (CHS) trong Arabidopsis. Chúng tôi chứng minh sự biểu hiện smiRNA(CHS) và sự cắt mRNA CHS trong các dòng chuyển gen khác nhau. Những thay đổi về kiểu hình trong các dòng này đã được quan sát về màu sắc hạt và các dẫn xuất flavonol, và được định lượng liên quan đến hàm lượng anthocyanin. Chúng tôi cũng đã thử nghiệm ảnh hưởng của các vị trí không khớp và cặp nucleotide G:U dư thừa đến hiệu quả giảm thiểu gene. Thiết kế smiRNAs hỗ trợ bởi RNAhybrid và việc tạo ra pri-smiRNAs bằng cách sử dụng một vector mới chứa các vị trí cắt hạn chế đã cải thiện đáng kể tính đặc hiệu và tốc độ tạo ra các dòng knockdown ổn định cho các phân tích chức năng ở thực vật.
Từ khóa
#microRNAs #thiết kế #tạo ra #dòng knockdown đặc hiệu #Arabidopsis #gene #chalcone synthaseTài liệu tham khảo
Bartel DP: MicroRNAs: Genomics, Biogenesis, Mechanism and Fuction. Cell. 2004, 116: 281-297. 10.1016/S0092-8674(04)00045-5.
Reinhart BJ, Weinstein EG, Rhoades MW, Bartel B, Bartel DP: MicroRNAs in plants. Genes Dev. 2002, 16: 1616-1626. 10.1101/gad.1004402.
Baskerville S, Bartel DP: Microarray profiling of microRNAs reveals frequent coexpression with neighboring microRNAs and host genes. RNA. 2005, 11: 241-247. 10.1261/rna.7240905.
Rhoades MW, Reinhart BJ, Lim LP, Burge CB, Bartel B, Bartel DP: Prediction of plant microRNA targets. Cell. 2002, 110: 513-520. 10.1016/S0092-8674(02)00863-2.
Reinhart B, Slack F, Basson M, Pasquinelli A, Bettinger J, Rougvie A, Horvitz R, Ruvkun G: The 21-nucleotide let-7 RNA regulates developmental timing in Caenorhabditis elegans. Nature. 2000, 403: 901-906. 10.1038/35002607.
Lewis BP, Burge CB, Bartel DP: Conserved seed pairing, often flanked by adenosines, indicates that thousands of human genes are microRNA targets. Cell. 2005, 120: 15-20. 10.1016/j.cell.2004.12.035.
Ding L, Spencer A, Morita K, Han M: The developmental time regulator AIN-1 interacts with miRISCs and may target the Argonaute protein ALG-1 to cytoplasmic P- bodies in C. elegans . Mol Cell. 2005, 19: 437-447. 10.1016/j.molcel.2005.07.013.
Brodersen P, Voinnet O: Revisiting the principles of microRNA target recognition and mode of action. Nature Reviews. 2009, 10: 141-148.
Brodersen P, Sakvarelidze-Achard L, Bruun-Rasmussen M, Dunoyer P, Yamamoto YY, Sieburth L, Voinnet O: Widespread translational inhibition by plant miRNAs and siRNAs. Science. 2008, 320: 1185-1190. 10.1126/science.1159151.
Llave C, Xie Z, Kasschau KD, Carrington JC: Cleavage of Scarecrow-like mRNA targets directed by a class of Arabidopsis miRNA. Science. 2002, 297: 2053-2056. 10.1126/science.1076311.
Palatnik JF, Allen E, Wu X, Schommer C, Schwab R, Carrington JC, Weigel D: Control of leaf morphogenesis by microRNAs. Nature. 2003, 425: 257-263. 10.1038/nature01958.
Jones-Rhoades MW, Bartel DP: Computational identification of plant microRNAs and their targets, including a stress-induced microRNA. Mol Cell. 2004, 14: 787-799. 10.1016/j.molcel.2004.05.027.
Wang XJ, Reyes JL, Chua NH, Gaasterland T: Prediction and identification of Arabidopsis thaliana microRNAs and their mRNA targets. Genome Biol. 2004, 5: R65-10.1186/gb-2004-5-9-r65.
Xie Z, Allen E, Fahlgren N, Calamar A, Givan SA: Expression of Arabidopsis miRNA genes. Plant Physiol. 2005, 138: 2145-2154. 10.1104/pp.105.062943.
Lu C, Tej SS, Luo S, Haudenschild CD, Meyers BC, Green PJ: Elucidation of the small RNA component of the transcriptome. Science. 2005, 309: 1567-1569. 10.1126/science.1114112.
Rajagopalan R, Vaucheret H, Trejo J, Bartel DP: A diverse and evolutionarily fluid set of microRNAs in Arabidopsis thaliana . Genes Dev. 2006, 20: 3407-3425. 10.1101/gad.1476406.
Fahlgren N, Howell MD, Kasschau KD, Chapman EJ, Sullivan CM, Cumbie JS, Givan SA, Law TF, Grant SR, Dangl JL, Carrington JC: High-Throughput Sequencing of Arabidopsis microRNAs: Evidence for Frequent Birth and Death of MIRNA Genes. PLoS ONE. 2007, 2: e219-10.1371/journal.pone.0000219.
Bonnet E, Wuyts J, Rouze P, Peer Van de Y: Evidence that microRNA precursors, unlike other non-coding RNAs, have lower folding free energies than random sequences. Bioinformatics. 2004, 20: 2911-2917. 10.1093/bioinformatics/bth374.
Parizotto EA, Dunoyer P, Rahm N, Himber C, Voinnet O: In vivo investigation of the transcription, processing, endonucleolytic activity, and functionalrelevance of the spatial distribution of a plant microRNA. Genes Dev. 2004, 18: 2237-2242. 10.1101/gad.307804.
Alvarez JP, Pekker I, Goldshmidt A, Blum E, Amsellem Z, Eshed Y: Endogenous and synthetic microRNAs stimulate simultaneous, efficient, and localized regulation of multiple targets in diverse species. Plant Cell. 2006, 18: 1134-1151. 10.1105/tpc.105.040725.
Schwab R, Ossowski S, Riester M, Warthmann N, Weigel D: Highly specific gene silencing by synthetic microRNAs in Arabidopsis. The Plant Cell. 2006, 18: 1121-1133. 10.1105/tpc.105.039834.
Niu QW, Lin S-S, Reyes JL, Chen KC, Wu HW, Yeh SD, Chua NH: Expression of synthetic microRNAs in transgenic Arabidopsis thaliana confers virus resistance. Nature. 2006, 24: 1420-1428. 10.1038/nbt1255.
Rehmsmeier M, Steffen P, Höchsmann M, Giegerich R: Fast and effective prediction of microRNA/target duplexes. RNA. 2004, 10: 1507-1517. 10.1261/rna.5248604.
Pelletier MK, Burbulis IE, Winkel-Shirley B: Disruption of specific flavonoid genes enhances the accumulation of flavonoid enzymes and end-products in Arabidopsis seedlings. Plant Mol. 1999, 40: 45-54. 10.1023/A:1026414301100.
Winkel-Shirley B: Flavonoid biosynthesis. A colorful model for genetics, biochemistry, cell biology, and biotechnology. Plant Physiol. 2001, 126: 485-493. 10.1104/pp.126.2.485.
Koornneef M, Luiten W, de Vlsming P, Schram AW: Mutations affecting the testa color in Arabidopsis . Arabidopsis Inf Serv. 1990, 19: 113-115.
Alves-Junior L, Niemeier S, Hauenschild A, Rehmsmeier M, Merkle T: Comprehensive prediction of novel microRNA targets in Arabidopsis thaliana. Nucleic Acids Res. 2009, 37: 4010-4021. 10.1093/nar/gkp272.
Ho SN, Hunt HD, Horton RM, Pullen JK, Pease LR: Site-directed mutagenesis by overlap extension using polymerase chain reaction. Gene. 1989, 77: 51-59. 10.1016/0378-1119(89)90358-2.
Mathews DH, Sabina J, Zuker M, Turner DH: Expanded sequence dependence of thermodynsmic parameters improves prediction of RNA secondary structure. J Mol Biol. 1999, 288: 911-940. 10.1006/jmbi.1999.2700.
Sheahan JJ, Rechnitz GA: Flavonoid-specific staining of Arabidopsis thaliana. Biotechniques. 1992, 13: 880-883.
Teng S, Keurentjes J, Bentsink L, Koornneef M, Smeekens S: Sucrose-specific induction of anthocyanin biosynthesis in Arabidopsis requires the MYB75/PAP1 gene. Plant Physiol. 2005, 139: 1840-1852. 10.1104/pp.105.066688.
Ossowski S, Schwab R, Weigel D: Gene silencing in plants using artificial microRNAs and other small RNAs. Plant J. 2008, 53: 674-690. 10.1111/j.1365-313X.2007.03328.x.
Watson JM, Fusaro AF, Wang M, Waterhouse PM: RNA silencing platforms in plants. FEBS Lett. 2005, 579: 5982-5987. 10.1016/j.febslet.2005.08.014.
Debeaujon I, Peeters AJ, Leon-Kloosterziel KM, Koornneef M: The TRANSPARENT TESTA12 gene of Arabidopsis encodes a multidrug secondary transporter-like Protein required for flavonoid sequestration in vacuoles of the seed coat endothelium. Plant Cell. 2001, 13: 853-871. 10.1105/tpc.13.4.853.
Schwab R, Palatnik JF, Riester M, Schommer C, Schmid M, Weigel D: Specific effects of microRNAs on the plant transcriptome. Dev Cell. 2005, 8: 517-527. 10.1016/j.devcel.2005.01.018.
Mallory AC, Reinhart BJ, Jones-Rhoades MW, Tang G, Zamore PD, Barton MK, Bartel DP: MicroRNA control of PHABULOSA in leaf development: importance of pairing to the microRNA 5' region. EMBO J. 2004, 23: 3356-3364. 10.1038/sj.emboj.7600340.
Mi S, Cai T, Hu Y, Chen Y, Hodges E, Ni F, Wu L, Li S, Zhou H, Long C, Chen S, Hannon GJ, Qi Y: Sorting of small RNAs into Arabidopsis Argonaute complexes is directed by the 5' terminal nucleotide. Cell. 2008, 133: 116-127. 10.1016/j.cell.2008.02.034.
Park MY, Wu G, Gonzalez-Sulser A, Vaucheret H, Poethig RS: Nuclear processing and export of microRNAs in Arabidopsis. Proc Natl Acad Sci USA. 2005, 102: 3691-3696. 10.1073/pnas.0405570102.
Zhang Z, Schwartz S, Wagner L, Miller W: A greedy algorithm for aligning DNA sequences. J Comput Biol. 2000, 7: 203-214. 10.1089/10665270050081478.
Thompson JD, Higgins DG, Gibson TJ: CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignments through sequence weighting, position specific gap penalties and weight matrix choice. Nucl Acids Res. 1994, 22: 4673-4680. 10.1093/nar/22.22.4673.
Haasen D, Köhler C, Neuhaus G, Merkle T: Nuclear export of proteins in plants: AtXPO1 is the export receptor for leucine-rich nuclear export signals in Arabidopsis thaliana. Plant J. 1999, 20: 695-705. 10.1046/j.1365-313X.1999.00644.x.
Becker D, Kemper E, Schell J, Masterson R: New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left T-DNA border. Plant Mol Biol. 1992, 20 (6): 1195-1197. 10.1007/BF00028908.
Pfaffl MW: A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Res. 2001, 29: 2002-2007. 10.1093/nar/29.9.e45.