Minoo Battiwalla1, Sheila Sait1, AnneMarie W. Block1, Ibrahim Kebbewar1, Manmeet S. Ahluwalia1, Earl A. Timm1, Paul K. Wallace1
1Roswell Park Cancer Institute, Buffalo, NY, USA
Tóm tắt
Tóm tắt
Sự kết hợp giữa FACS và FISH đã được sử dụng để xác định các bất thường di truyền phân tử trong quần thể tế bào nhỏ trong các bệnh như đa u tủy xương. Chúng tôi mô tả sự tinh chỉnh và ứng dụng kỹ thuật này ở một bệnh nhân đã được biết đến mắc MDS/PNH nhằm phân tích nguồn gốc sinh sản của chứng rối loạn này. Đối tượng là một người phụ nữ 45 tuổi mắc MDS được chẩn đoán năm năm trước khi bà có mặt với triệu chứng thiếu máu đại bào và giảm tiểu cầu. Tủy xương có tế bào ít (20% tế bào), với 4% tế bào blast, FAB-RA, WHO-RCMD, Trung gian-1 theo IPSS, và phát hiện biến thể del 20q qua FISH. Tiền sử gia đình có dấu hiệu liên quan đến bệnh lý giảm tế bào máu với hai chị em phát triển suy tủy xương, nhưng âm tính với di truyền biến thể hTERC. Loại HLA DRB1 là 0101;1301. Không có bằng chứng cho T-LGL qua phân tích dòng tế bào hoặc thử nghiệm tái sắp xếp gen TCR. Quản lý chỉ mang tính quan sát mà không cần truyền máu. Một biến thể PNH mới đã được phát hiện lần đầu tiên qua phân tích dòng sáu tháng trước. Máu đã được xử lý bởi phòng thí nghiệm vào cùng ngày thu thập. Các tế bào bạch cầu đã được tách biệt khỏi hồng cầu bằng cách kết hợp ly tâm dextran và tiêu hủy hồng cầu bằng nhôm clorua. IgG chuột bình thường (3mg/mL) được thêm vào để chặn các thụ thể Fc. Các tế bào được nhuộm bằng cocktail kháng thể đơn dòng chứa CD16 PE (Clone 3G8, Invitrogen), CD55 PC5 (clone IA10, BD Bioscience) và CD15 APC (clone HI98, BD Bioscience) dành cho bạch cầu hạt; hoặc CD14 PE (clone TUK4, Invitrogen), CD55 PC5 và CD64 (clone M22, Trillium) dành cho đại thực bào. Cùng với nhuộm kháng thể đơn dòng, proaerolysin (FLAER Ax488, Protox Biotech) đã được thêm vào mỗi ống. Các tế bào được ủ cùng với kháng thể đơn dòng và thuốc thử FLAER ở nồng độ bão hòa trong bóng tối, trên băng, trong 30 phút. Sau đó, chúng được rửa một lần bằng PBS, cố định trong dung dịch formaldehyde không methanol 0.5% (Polysciences, Warrington, PA) trong 20 phút và cuối cùng hòa tan lại trong PBS. Phân tích và phân loại cytofluorometric được thực hiện bằng cách sử dụng máy phân tích dòng FACSAria (BD BioSciences). Bạch cầu hạt được xác định bằng cách sử dụng sự kết hợp Boolean từ kết tủa trước, bên và CD15; đại thực bào được xác định bằng kết tủa trước, bên và CD64. Bạch cầu hạt và đại thực bào được phân loại thành các tế bào PNH dương tính và âm tính dựa trên biểu hiện của FLAER, CD55 và hoặc CD16 (bạch cầu hạt) hoặc CD14 (đại thực bào). Dữ liệu được phân tích bằng phần mềm WinList (Verity Software House, Topsham, ME). Phân tích FISH cho del(20q) đã được thực hiện trên các tế bào này bằng cách sử dụng Probes Vysis LSI D20S108 SpectrumOrange (Abbott Molecular Inc.). Kết quả của chúng tôi (bảng 1) cho thấy rằng biến thể PNH (FLAER âm tính) là một quần thể biệt lập không chồng lấn với quần thể loạn sản del(20q).
Kết luận: Kỹ thuật phân loại bằng dòng của chúng tôi theo sau bởi FISH là khả thi cho việc làm giàu và phân tích các phân khúc tế bào PNH dương tính và âm tính trong các trạng thái suy tủy xương. Biến thể PNH trong bệnh nhân này, trái ngược với các báo cáo khác trong tài liệu, không chồng lấn với biến thể MDS, mà phát sinh từ các tế bào bình thường không loạn sản phù hợp với cơ chế giả thuyết về sự thoát khỏi miễn dịch. Kỹ thuật này là một công cụ mạnh mẽ cho lâm sàng hoặc nghiên cứu nhằm làm sáng tỏ nguồn gốc sinh sản trong các trạng thái suy tủy xương liên quan đến PNH.
Bảng 1 Trước khi phân loại Sau khi phân loại 20q− theo FISH Bạch cầu không phân loại 13/200 Đại thực bào PNH− 67% 76% 34/200 PNH+ 245 81% 5/200 = đối chứng âm tính Bạch cầu hạt PNH− 72% 94% 34/200 PNH+ 26% 94% 5/200 = đối chứng âm tính
