Thiết lập phương pháp định lượng nhạy cảm dựa trên huỳnh quang cho các nucleotide vòng

Springer Science and Business Media LLC - Tập 20 - Trang 1-10 - 2020
Nadine Gruteser1, Viktoria Kohlhas1,2, Sabine Balfanz1, Arne Franzen1, Anne Günther1,3, Andreas Offenhäusser4, Frank Müller1, Viacheslav Nikolaev5, Martin J. Lohse6,7, Arnd Baumann1
1Institute of Biological Information Processing (Molecular and Cellular Physiology, IBI-1), Forschungszentrum Jülich, Jülich, Germany
2Present address: CECAD Research Center, Cologne, Germany
3Present address: RIKEN Center for Brain Science, Saitama, Japan
4Institute of Biological Information Processing (Bioelectronics, IBI-3), Forschungszentrum Jülich, Jülich, Germany
5Institute of Experimental Cardiovascular Research, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, Hamburg, Germany
6Institute of Pharmacology and Toxicology, University of Würzburg, Würzburg, Germany
7Max-Delbrück-Center for Molecular Medicine, Berlin, Germany

Tóm tắt

Khoảng 40% thuốc được kê đơn có tác dụng thông qua các thụ thể kết hợp protein GTP (GPCRs). Khi được kích hoạt, các thụ thể này gây ra những thay đổi tạm thời trong nồng độ của các thông tin thứ cấp, ví dụ như adenosine 3′,5′-monophosphate (cAMP). Các cảm biến sinh học được mã hóa gen cụ thể và hiệu quả đã được phát triển để theo dõi sự dao động của cAMP với độ phân giải không gian và thời gian cao trong tế bào sống hoặc mô. Một cảm biến sinh học được định nghĩa rõ ràng cho cAMP là protein Epac1-camps dựa trên chuyển giao năng lượng cộng hưởng Förster (FRET). Việc đặc trưng dược lý của các ligand mới phát triển tác động lên GPCRs thường bao gồm việc định lượng số lượng thông tin thứ cấp được tạo ra. Để định lượng nồng độ cAMP trong tế bào, chúng tôi đã biểu hiện quá mức vi khuẩn và tinh sạch Epac1-camps và áp dụng protein tinh sạch vào một thử nghiệm phát hiện không có tế bào cho cAMP theo định dạng đa lỗ. Chúng tôi phát hiện rằng cảm biến sinh học có thể phát hiện cAMP chỉ với 0.15 pmol, và độ nhạy không bị ảnh hưởng bởi nồng độ muối không sinh lý hoặc giá trị pH. Đặc biệt, thử nghiệm đã cho thấy khả năng chống khô và bảo quản protein mà không làm ảnh hưởng đến độ nhạy của Epac1-camps đối với nucleotide vòng. Chúng tôi nhận thấy việc xác định cAMP trong lysates thu được từ các thử nghiệm tế bào hoặc mẫu mô qua Epac1-camps tinh khiết là một thử nghiệm mạnh mẽ, nhanh chóng và nhạy cảm, phù hợp cho các phân tích định kỳ và phân tích với quy mô lớn.

Từ khóa

#GTP-binding protein #GPCR #cAMP #biosensors #FRET #Epac1-camps #nucleotide vòng #định lượng.

Tài liệu tham khảo

An WF, Tolliday N. Cell-based assays for high-throughput screening. Mol Biotechnol. 2010;45:180–6 https://doi.org/10.1007/s12033-010-9251-z. Balfanz S, Strünker T, Frings S, Baumann A. A family of octopamine receptors that specifically induce cyclic AMP production or Ca2+ release in Drosophila melanogaster. J Neurochem. 2005;93:440–51 https://doi.org/10.1111/j.1471-4159.2005.03034.x. Biel M, Michalakis S. Function and dysfunction of CNG channels: insights from channelopathies and mouse models. Mol Neurobiol. 2007;35:266–77 https://doi.org/10.1007/978-3-540-68964-5_7. Biel M, Wahl-Schott C, Michalakis S, Zong X. Hyperpolarization-activated cation channels: from genes to function. Physiol Rev. 2009;89:847–85 https://doi.org/10.1152/physrev.00029.200. Blenau W, Baumann A. Octopaminergic and tyraminergic signaling in the honeybee (Apis mellifera) brain: behavioral, pharmacological, and molecular aspects in Tahira Farooqui and Akhlaq Farooqui, editors, trace amines and neurological disorders. Oxford: Academic Press; 2016. p. 203–20. Brand T, Schindler R. New kids on the block: the Popeye domain containing (POPDC) protein family acting as a novel class of cAMP effector proteins in striated muscle. Cell Signal. 2017;40:156–65 https://doi.org/10.1016/j.cellsig.2017.09.015. Brown JT, Kant A, Mailman RB. Rapid, semi-automated, and inexpensive radioimmunoassay of cAMP: application in GPCR-mediated adenylate cyclase assays. J Neurosci Methods. 2009;177:261–6 https://doi.org/10.1016/j.jneumeth.2008.10.016. Cano-Abad MF, Di Benedetto G, Magalhaes PJ, Filippin L, Pozzan T. Mitochondrial pH monitored by a new engineered green fluorescent protein mutant. J Biol Chem. 2004;279:11521–9 https://doi.org/10.1074/jbc.M306766200. Chen H-L, McCauley LK, D’Silva NJ. cAMP binding protein assay for widespread use in cell signaling studies. Biotechniques. 2002;33:66–72 https://doi.org/10.2144/02331st03. Chi CW, Ahmed AR, Dereli-Korkut Z, Wang S. Microfluidic cell chips for high-throughput drug screening. Bioanalysis. 2016;8:921–37 https://doi.org/10.4155/bio-2016-0028. Chiulli AC, Trompeter K, Palmer M. A novel high throughput chemiluminescent assay for the measurement of cellular cyclic adenosine monophosphate levels. J Biomol Screen. 2000;5:239–48 https://doi.org/10.1177/108705710000500406. de Rooij J, Zwartkruis FJ, Verheijen MH, Cool RH, Nijman SM, Wittinghofer A, Bos JL. Epac is a Rap1 guanine-nucleotide-exchange factor directly activated by cyclic AMP. Nature. 1998;396:474–7 https://doi.org/10.1038/24884. Frandsen EK, Krishna G. A simple ultrasensitive method for the assay of cyclic AMP and cyclic GMP in tissues. Life Sci. 1976;18:529–41 https://doi.org/10.1016/0024-3205(76)90331-3. Germond A, Fujita H, Ichimura T, Watanabe TM. Design and development of genetically encoded fluorescent sensors to monitor intracellular chemical and physical parameters. Biophys Rev. 2016;8:121–38 https://doi.org/10.1007/s12551-016-0195-9. Ghigo A, Mika D. cAMP/PKA signaling compartmentalization in cardiomyocytes: lessons from FRET-based biosensors. J Mol Cell Cardiol. 2019;131:112–21 https://doi.org/10.1016/j.yjmcc.2019.04.020. Gilman AG. A protein binding assay for adenosine 3′:5′-cyclic monophosphate. Proc Natl Acad Sci U S A. 1970;67:305–12 https://doi.org/10.1073/pnas.67.1.305. Harper JF, Brooker G. Femtomole sensitive radioimmunoassay for cyclic AMP and cyclic GMP after 2'O acetylation by acetic anhydride in aqueous solution. J Cyclic Nucleotide Res. 1975;1:207–18. He C, Chen F, Li B. Hu Z. Neurophysiology of HCN channels: from cellular functions to multiple regulations. Prog Neurobiol. 2014;112:1–23 https://doi.org/10.1016/j.pneurobio.2013.10.001. Hofer AM. Interactions between calcium and cAMP signaling. Curr Med Chem. 2012;19:5768–73 https://doi.org/10.2174/092986712804143286. Kaupp UB, Seifert R. Molecular diversity of pacemaker ion channels. Annu Rev Physiol. 2001;63:235–57 https://doi.org/10.1146/annurev.physiol.63.1.235. Kaupp UB, Seifert R. Cyclic nucleotide-gated ion channels. Physiol Rev. 2002;82:769–824 https://doi.org/10.1152/physrev.00008.2002. Kelly MP. Cyclic nucleotide signaling changes associated with normal aging and age-related diseases of the brain. Cell Signal. 2018;42:281–91 https://doi.org/10.1016/j.cellsig.2017.11.004. Llopis J, McCaffery JM, Miyawaki A, Farquhar MG, Tsien RY. Measurement of cytosolic, mitochondrial, and Golgi pH in single living cells with green fluorescent proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 1998;95:6803–8 https://doi.org/10.1073/pnas.95.12.6803. Looger LL, Griesbeck O. Genetically encoded neural activity indicators. Curr Opin Neurobiol. 2012;22:18–23 https://doi.org/10.1016/j.conb.2011.10.024. Maqueira B, Chatwin H, Evans P. Identification and characterization of a novel family of Drosophila β-adrenergic-like octopamine G-protein coupled receptors. J Neurochem. 2005;94:547–60 https://doi.org/10.1111/j.1471-4159.2005.03251.x. Nikolaev VO, Bünemann M, Hein L, Hannawacker A, Lohse MJ. Novel single chain cAMP sensors for receptor-induced signal propagation. J Biol Chem. 2004;279:37215–8 https://doi.org/10.1074/jbc.C400302200. Patel N, Gold MG. The genetically encoded tool set for investigating cAMP: more than the sum of its parts. Front Pharmacol. 2015;6:164 https://doi.org/10.3389/fphar.2015.00164. Pegoraro G, Misteli T. High-throughput imaging for the discovery of cellular mechanisms of disease. Trends Genet. 2017;33:604–15 https://doi.org/10.1016/j.tig.2017.06.005. Piercek L, Premont RT, Lefkowitz RJ. Seven-transmembrane receptors. Nat Rev Mol Cell Biol. 2002;3:639–50 https://doi.org/10.1038/nrm908. Ren J, Mi Z, Stewart NA, Jackson EK. Identification and quantification of 2′,3′-cAMP release by the kidney. J Pharmacol Exp Ther. 2009;328:855–65 https://doi.org/10.1124/jpet.108.146712. Rodriguez EA, Campbell RE, Lin JY, Lin MZ, Miyawaki A, Palmer AE, Shu X, Zhang J, Tsien RY. The growing and glowing toolbox of fluorescent and photoactive proteins. Trends Biochem Sci. 2017;42:111–29 https://doi.org/10.1016/j.tibs.2016.09.010. Roeder T. Tyramine and octopamine: ruling behavior and metabolism. Annu Rev Entomol. 2005;50:447–77 https://doi.org/10.1146/annurev.ento.50.071803.130404. Rost BR, Schneider-Warme F, Schmitz D, Hegemann P. Optogenetic tools for subcellular applications in neuroscience. Neuron. 2017;96:572–603 https://doi.org/10.1016/j.neuron.2017.09.047. Shigetomi E, Kracun S, Sofroniew MV, Khakh BS. A genetically targeted optical sensor to monitor calcium signals in astrocyte processes. Nat Neurosci. 2010;13:759–66 https://doi.org/10.1038/nn.2557. Sprenger JU, Nikolaev VO. Biophysical techniques for detection of cAMP and cGMP in living cells. Int J Mol Sci. 2013;14:8025–46 https://doi.org/10.3390/ijms14048025. Stangherlin A, Koschinski A, Terrin A, Zoccarato A, Jiang H, Fields LA, Zaccolo M. Analysis of compartmentalized cAMP: a method to compare signals from differently targeted FRET reporters. Methods Mol Biol. 2014;1071:59–71 https://doi.org/10.1007/978-1-62703-622-1_5. Zaccolo M. Spatial control of cAMP signalling in health and disease. Curr Opin Pharmacol. 2011;11:649–55 https://doi.org/10.1016/j.coph.2011.09.014. Zhang D, Zhao Q, Wu B. Structural studies of G protein-coupled receptors. Mol Cell. 2015;38:836–42 https://doi.org/10.14348/molcells.2015.0263.
Thông tin
Thông tin xuất bản

Springer Science and Business Media LLC

Tập 20

1-10

Thông tin tác giả