Nội dung được dịch bởi AI, chỉ mang tính chất tham khảo
Kỹ thuật sửa đổi protease serine kiềm từ Bacillus pumilus nhằm tăng cường hoạt động phân hủy protein ở nhiệt độ thấp thông qua tiến hóa có định hướng
Tóm tắt
Các protease serine kiềm trung nhiệt từ nhiều loại vi khuẩn đã được ứng dụng thương mại trong một loạt các ngành công nghiệp nhờ vào hiệu suất xúc tác cao và tính đặc hiệu nền tảng rộng rãi của chúng. Tuy nhiên, các protease này có nhiệt độ tối ưu xúc tác khoảng 50 °C, và hoạt động của chúng giảm đáng kể ở nhiệt độ thấp. Do đó, để tăng cường hoạt động lạnh của chúng, cần phải cải thiện hiệu suất xúc tác của các protease này ở nhiệt độ thấp. Protease serine kiềm (DHAP) từ Bacillus pumilus BA06 là một enzym trung nhiệt điển hình, đã chứng minh tiềm năng lớn trong nhiều ứng dụng công nghiệp. Tại đây, chúng tôi đã cố gắng cải thiện hoạt động lạnh của DHAP thông qua tiến hóa có định hướng. Bảy biến thể (P9S, A1G/K27Q, A38V, A116T, T162I, S182R và T243S) của DHAP từ B. pumilus đã được thu nhận thông qua tiến hóa có định hướng. Kết quả cho thấy tất cả các biến thể đều có hoạt động phân hủy protein tăng lên ở 15 °C đối với cả hai nền casein và peptide tổng hợp. Với ngoại lệ của biến thể T243S, tính ổn định nhiệt của các biến thể này không giảm so với enzym hoang dã. Phân tích động học chỉ ra rằng sự tăng cường hiệu suất xúc tác chủ yếu do sự tăng số lượng chu kỳ (kcat). Hơn nữa, các biến thể kết hợp được tạo ra bằng phương pháp đột biến có định hướng đã thể hiện sự gia tăng thêm về hoạt động phân hủy casein đặc hiệu và giá trị kcat cho sự phân hủy peptide tổng hợp. Các biến thể kết hợp của P9S/K27Q và P9S/T162I cho thấy sự gia tăng khoảng 5 lần về hoạt động phân hủy casein ở 15 °C và gần như không mất ổn định nhiệt. Cuối cùng, cơ chế có thể chịu trách nhiệm cho sự thay đổi trong các tính chất xúc tác của các biến thể này được giải thích dựa trên mô hình cấu trúc. Tiến hóa có định hướng và đột biến có định hướng đã được kết hợp để chế tạo các biến thể của DHAP từ B. pumilus. Tất cả các biến thể đều thể hiện sự tăng cường hiệu suất thủy phân ở nhiệt độ thấp đối với cả hai nền, casein và peptide tổng hợp, mà không mất ổn định nhiệt so với dạng hoang dã. Dữ liệu này gợi ý rằng việc điều chỉnh hoạt động ở nhiệt độ thấp cho một protease vi khuẩn không nhất thiết liên quan đến việc mất ổn định nhiệt. Hơn nữa, các phát hiện của chúng tôi minh chứng rằng hoạt động lạnh được cải thiện và tính ổn định nhiệt có thể được tích hợp vào một biến thể đơn.
Từ khóa
#Protease serine kiềm #Bacillus pumilus #hoạt động lạnh #tiến hóa có định hướng #tính ổn định nhiệt.Tài liệu tham khảo
Gupta R, Beg QK, Lorenz P. Bacterial alkaline proteases: molecular approaches and industrial applications. Appl Microbiol Biotechnol. 2002;59:15–32.
Niyonzima FN, More S. Detergent-compatible proteases: microbial production, properties, and stain removal analysis. Prep Biochem Biotech. 2015;45:233–58.
Bryan PN. Protein engineering of subtilisin. Biochim Biophys Acta. 2000;1543:203–22.
Polgár L. The catalytic triad of serine peptidases. Cell Mol Life Sci. 2005;62:2161–72.
Feller G. Psychrophilic enzymes: from folding to function and biotechnology. Scientica. 2013:Article ID 512840.
Martinez R, Jakob F, Tu R, Maurer K-H, Schwaneberg U. Increasing activity and thermal resistance of Bacillus gibsonii alkaline protease (BgAP) by directed evolution. Biotechnol Bioeng. 2013;110:711–20.
Davies MJ, Feller G, Narinx E, Gerday C. Purification, characterization, and sequence of the heat-labile subtilisin from the Antarctic psychrophile Bacillus TA41. J Biol Chem. 1994;269:17448–53.
Acevedo JP, Rodriguez V, Saavedra M, Munoz M, Salazar O, Asenjo JA, Andrews BA. Cloning, expression and decoding of the cold adaptation of a new widely represented thermolabile subtilisin-like protease. J Appl Microbiol. 2012;114:352–63.
Zhong C-Q, Song S, Fang N, Liang X, Zhu H, Tang X-F, Tang B. Improvement of low-temperature caseinolytic activity of a thermophilic subtilase by directed evolution and site-directed mutagenesis. Biotechnol Bioeng. 2009;104:862–70.
Yang Y-R, Zhu H, Fang N, Liang X, Zhong C-Q, Tang X-F, Tang B. Cold-adapted maturation of thermophilic WF146 protease by mimicking the propeptide binding interactions of psychrophilic subtilisin S41. FEBS Lett. 2008;582:2620–6.
Kano H, Taguchi S, Momose H. Cold adaptation of a mesophilic serine protease, subtilisin, by in vitro random mutagenesis. Appl Microbiol Biotechnol. 1997;47:46–51.
Wintrode PL, Miyazaki K, Arnold HF. Cold adaptation of a mesophilic subtilisin-like protease by laboratory evolution. J Biol Chem. 2000;275:31635–40.
Han X-Q, Damodaran S. Isolation, identification, and fermentation of a Bacillus species producing a detergent-stable endopeptidase. J Agric Food Chem. 1997;45:4191–5.
Jaouadi B, Ellouz-Chaaboum S, Rhimi M, Bejar S. Biochemical and molecular characterization of a detergent-stable serine alkaline protease from Bacillus pumilus CBS with high catalytic efficiency. Biochimie. 2008;90:1291–305.
Huang Q, Peng Y, Li X, Wang H, Zhang Y. Purification and characterization of an extracellular alkaline serine protease with dehairing function from Bacillus pumilus. Curr Microbiol. 2003;46:169–73.
Rahman RNZRA, Mahamad S, Salleh ABM, Basri M. A new organic solvent tolerant protease from Bacillus pumilus 115b. J Ind Microbiol Biotech. 2007;34:509–17.
Baweja M, Tiwari R, Singh PK, Nain L, Shukla P. An alkaline protease from Bacillus pumilus MP 27: functional analysis of its binding model toward its applications as detergent additive. Front Microbiol. 2016;7:1195.
Rawlings ND, Barrett AJ, Bateman A. MEROPS: the peptidase database. Nucleic Acids Res. 2011;38(Suppl.1):D227–33.
Feng H, Wang H-Y, Zhang Y-Z. Endopeptidase Q. In: Rawlings ND, Salvesen GS eds. Handbook of proteolytic enzymes, 3rd ed. Oxford, UK, Academic Press. 2013;3182–3188.
Jaouadi B, Aghajari Haser NR, Bejar S. Enhancement of the thermostability and catalytic efficiency of Bacillus pumilus CBS protease by site-directed mutagenesis. Biochimie. 2010;92:360–9.
Wan M-Y, Wang H-Y, Zhang Y-Z, Feng H. Substrate specificity and thermostability of the dehairing alkaline protease from Bacillus pumilus. Appl Biochem Biotechnol. 2009;159:394–403.
Wang H-Y, Liu D-M, Liu Y, Cheng C-F, Q-Y Q-Y, Huang Q, Zhang Y-Z. Screening and mutagenesis of a novel Bacillus pumilus strain producing alkaline protease for dehairing. Lett Appl Microbiol. 2007;44:1–6.
Huang R, Yang Q-J, Feng H. Single amino acid mutation alters thermostability of the alkaline protease from Bacillus pumilus: thermodynamics and temperature dependence. Acta Biochim Biophys Sin. 2015;47:98–105.
Zhao H-Y, Wu L-Y, Liu G, Feng H. Single-site substitutions improve cold activity and increase thermostability of the dehairing alkaline protease (DHAP). Biosci Biotechnol Biochem. 2016;80:2480–5.
Wu XC, Lee W, Tran L, Wong SL. Engineering a Bacillus subtilis expression-secretion system with a strain deficient in six extracellular proteases. J Bacteriol. 1991;173:4952–8.
Wang Z, Wang H-Y, Feng H. A simple and reproducible method for directed evolution: combination of random mutation with dITP and DNA fragmentation with endonuclease V. Mol Biotechnol. 2013;53:49–54.
Dubnau D, Davidoff-Abelson R. Fate of transforming DNA following uptake by competent Bacillus subtilis. 1. Formation and properties of the donor–recipient complex. J Mol Biol. 1977;56:209–21.
Biasini M, Bienert S, Waterhouse A, Arnold K, Studer G, Schmidt T, Kiefer F, Cassarino TG, Bertoni M, Bordoli L, Schwede T. Swiss-model: modelling protein tertiary and quaternary structure using evolutionary information. Nucleic Acids Res. 2014;42:252–8.
Bobofchak KM, Pineda AO, Mathews FS, Di Cera E. Energetic and structural consequences of perturbing Gly-193 in the oxyanion hole of serine proteiases. J Biol Chem. 2005;280:25644–50.
Guex N, Peitsch MC. SWISS-MODEL and the Swiss-Pdb viewer: an environment for comparative protein modeling. Electrophoresis. 1997;18:2714–23.
Gerday C, Aittaleb M, Bentahir M, Chessa J-P, Claverie P, Coollins T, D’Amico S, Dumont J, Garsoux G, Georlette D, Hoyoux A, Lonhienne T, Meuwis MA, Feller G. Cold-adapted enzymes: from fundamentals to biotechnology. Trends Biotech. 2000;18:103–7.
Gianese G, Argos P, Pascarella S. Structural adaptation of enzymes to low temperatures. Protein Eng. 2001;14:141–8.
Miyazaki K, Wintrode PL, Grayling RA, Rubingh DN, Arnold HF. Directed evolution study of temperature adaptation in a psychrophilic enzyme. J Mol Biol. 1999;297:1015–26.
Arnórsdóttir J, Sigtryggsdóttir AR, Thorbjarnardóttir SH, Kristjánsso MM. Effect of proline substitutions on stability and kinetic properties of a cold adapted subtilase. J Biochem. 2009;145:325–9.
Prajapati RS, Das M, Sreeramulu S, Sirajuddin M, Srinivasan S, Krishnamurthy V, Ranjani R, Ramakrishnan C, Varadarajan R. Thermodynamic effects of proline introduction on protein stability. Proteins-Stru Funct. Bioinf. 2007;66:480–91.
Sakaguchi M, Matsuzaki M, Niimiya K, Seino J, Sugahara Y, Kawakita M. Role of proline residues in conferring thermostability on aqulysin I. J Biochem. 2007;141:213–20.
Fuchita N, Arita S, Ikuta Mirua JM, Shimomura M, Motoshima H, Watanabe K. Gly or ala substitutions for Pro210Thr211Asn212 at the β8-β9 turn of subtilisin Carlsberg increase the catalytic rate and decrease thermostability. Biochim Biophys Acta. 2012;1824:620–6.
Nestl BM, Hauer B. Engineering of flexible loops in enzymes. ACS Catal. 2014;4(4):3201–11.
Tindback N, Svendsen A, Oestergaard PR, Draborg H. Engineering a substrate-specific cold-adapted subtilisin. Prot Eng Des Sel. 2004;17:149–56.
Siddiqui KS. Defying the activity-stability trade-off in enzymes: taking advantage of entropy to enhance activity and thermostability. Crit Rev Biotechnol. 2017;37:309–22.
Pack SP, Kang TJ, Yoo YJ. Protein thermostability factors: high relative occurrence of amino acids, residual properties, and secondary structure type in different residual state. Appl Biochem Biotechnol. 2013;171:1212–26.
Okuda M, Ozawa T, Tohata M, Sato T, Saeki K, Ozaki K. A single mutation within a Ca2+ binding loop increases proteolytic activity, thermal stability, and surfactant stability. Biochim Biophys Acta. 2013;1843:634–41.
Graycar T, Knapp M, Ganshaw G, Dauberman J, Bott R. Engineered Bacillus lentus subtilisins having altered flexibility. J Mol Biol. 1999;292:97–109.
Kusano M, Yasukawa K, Inouye K. Effects of the mutational combinations on the activity and stability of thermolysin. J Biotech. 2010;147:7–16.