Anne-Louise Latif1, John J Cole1, Joana Monteiro Campos2, William Clark1, Lynn McGarry1, Claire Brock1, Ashley Newcombe1, Karen Keeshan2, Mhairi Copland2, Peter D Adams1
1Beatson Institute for Cancer Research, University of Glasgow, Glasgow, United Kingdom
2Paul O'Gorman Leukaemia Research Centre, University of Glasgow, Glasgow, United Kingdom
Tóm tắt
Tóm tắt
Nền tảng: Vẫn còn yêu cầu cấp thiết về các liệu pháp mới cho bệnh bạch cầu myeloid cấp tính (AML). Các chất ức chế bromodomain và miền ngoại vi (BET) đang nổi lên như những tác nhân điều trị đầy hứa hẹn cho các bệnh ác tính huyết học. Sự ức chế dược lý các bromodomain BET nhắm vào các tế bào ác tính bằng cách ngăn chặn việc đọc các dư lượng lysine acetyl hóa, từ đó làm gián đoạn quá trình truyền tín hiệu thông qua yếu tố nhiễm sắc, làm giảm quá trình phiên mã tại các vị trí oncogenic. Mặc dù là một bệnh không đồng nhất, phần lớn AML giữ lại dạng hoang dã của p53. Tuy nhiên, p53 thường bị thiếu hụt chức năng do sự biểu hiện quá mức của MDM2. Việc tăng cường phản ứng của p53 thông qua việc đối kháng với MDM2 do đó có thể mang lại lợi ích cho hầu hết các phân loại AML. Chúng tôi giả thuyết rằng việc ức chế đồng thời MDM2 và BET sẽ gây chết tế bào tổng hợp cho AML kiểu hoang dã p53.
Phương pháp: Đối với các thí nghiệm trong ống nghiệm, CPI203 (chất ức chế BET, Constellation Pharmaceuticals) và nutlin-3 (đối kháng MDM2, Sigma) đã được đánh giá trên các dòng tế bào kiểu hoang dã p53 (OCI-AML3, MOLM-13 và MV411) và bệnh nhân AML kiểu hoang dã p53 chính thống. Để đánh giá sự phụ thuộc của sự kết hợp này vào p53 kiểu hoang dã; các dòng tế bào có đột biến p53 (KG1a, KASUMI-1 và THP1) đã được thử nghiệm. Độ sống sót của tế bào được đánh giá bằng cách sử dụng resazurin (dye màu Alamar blue) trên nhiều tỷ lệ liều trên dòng tế bào OCI-AML3 và phân tích bằng Reader huỳnh quang Envision. Chỉ số kết hợp thuốc (CI) được đánh giá bằng cách sử dụng Calcusyn (phiên bản 2.0). Sự chết tế bào (apoptosis) được đánh giá bằng cách sử dụng phương pháp phân tích dòng tế bào cho Annexin V và iodide propidium (PI) trên tất cả các dòng tế bào kiểu hoang dã p53 và đột biến. Đối với các thí nghiệm trong sinh vật sống, CPI0610 (chất ức chế BET cấp lâm sàng, Constellation Pharmaceuticals) và RG7112 (chất ức chế MDM2, Roche) đã được thử nghiệm như các tác nhân đơn lẻ, kết hợp và với các đối chứng liên quan. Sequencing RNA đã được thực hiện trên bộ sequencer GAIIX và phân tích gene ontology được thực hiện bằng cách sử dụng phân tích con đường DAVID/INGENUITY (IPA).
Kết quả: Trong dòng tế bào OCI-AML3, phân tích resazurin cho thấy việc kết hợp CPI203 với nutlin-3 đã thể hiện tính đồng bộ mạnh mẽ khi giảm số lượng tế bào sống với tỷ lệ 1:12.5 (CI trung bình = 0.07) và 1:25 (CI trung bình = 0.299), và đồng bộ cho các tỷ lệ 1:50 (CI trung bình = 0.44) và 1:100 (CI trung bình = 0.66). Không có lợi ích nào khi sử dụng phương pháp điều trị kết hợp trên các dòng tế bào bị đột biến p53. Sự chết tế bào được cải thiện ít nhất 1.5 lần (trung vị 1.7, khoảng 1.5-2.65) bởi sự kết hợp thuốc so với các tác nhân đơn lẻ, trong bảng các dòng tế bào kiểu hoang dã p53 được thử nghiệm. Phân tích toàn bộ genom RNA seq trên các tế bào được điều trị OCI-AML3 cho thấy rằng các gen được tăng cường bởi việc kết hợp CPI203 và nutlin-3 đã có sự gia tăng gấp 30 lần cho tín hiệu p53 (FDR (<0.05)). Các gen bị giảm biểu hiện giàu có cho các gen tiến trình chu kỳ tế bào phụ thuộc FOXM1.
Để đánh giá sự kết hợp trong sinh vật sống, chúng tôi sử dụng bệnh AML chính do Trib-2 gây ra, nơi quá trình tạo bạch cầu được kích thích thông qua sự ức chế C/EBPα. Các tủy bào đã được truyền GFP trên cùng một cấu trúc retrovirus như Trib-2 để theo dõi bệnh. Điều trị được bắt đầu ở tất cả các chuột (n=40), sau khi xác nhận cấy ghép bệnh. Ba chuột từ mỗi nhóm điều trị được hy sinh sau 48 giờ và tế bào được phân loại cho GFP để thực hiện sequencing RNA trong bối cảnh in vivo này. Sau 21 ngày điều trị, tất cả chuột đã được hy sinh (n=27, một đối chứng phương tiện đã tử vong vì bệnh 15 ngày sau khi cấy ghép). Kết quả cuối cùng của điều trị (đọc chính là tỷ lệ GFP tương đương với tỷ lệ bạch cầu) cho thấy hiệu quả in vivo vượt trội của việc ức chế đồng thời MDM2 và BET so với các đối chứng trong việc tiêu diệt AML, p<0.0001, (xem hình). Quan trọng, quá trình tạo máu bình thường không bị ảnh hưởng - như được chứng minh bởi các chỉ số bạch cầu toàn phần bình thường và các quần thể tế bào myeloid, B-cell và T-cell tương đương với các đối chứng kiểu hoang dã C57bl6 của chúng tôi. Sequencing RNA của các bạch cầu murine đã tiết lộ rằng nhiều gen hơn có sự thay đổi biểu hiện quan trọng (FDR<0.05) ở chuột được điều trị bằng sự kết hợp hơn là chuột được điều trị bằng tác nhân đơn lẻ. Đường dẫn p53 là yếu tố điều chỉnh đầu nguồn phổ biến nhất của các gen thay đổi biểu hiện sau điều trị kết hợp, p<0.0001. Sự kết hợp này ảnh hưởng đến nhiều gen hơn trong đường dẫn p53 so với RG7112 đơn lẻ (120 gen so với 20 gen tương ứng), phù hợp với các kết quả in vitro của chúng tôi.
Kết luận: Sự kết hợp giữa ức chế BET và MDM2 là hiệu quả và vượt trội so với liệu pháp tác nhân đơn lẻ đối với tất cả AML kiểu hoang dã p53 được thử nghiệm, cả in vitro và in vivo. Trong cả hai bối cảnh, điều này liên quan đến việc tăng cường phản ứng của p53 và có thể có ý nghĩa với nhiều bệnh nhân mắc AML kiểu hoang dã p53.
Hình 1. Hình 1.
Công bố thông tin
Latif: Novartis: Thù lao. Copland: Ariad: Thù lao, Thành viên trong ban giám đốc hoặc ủy ban tư vấn của một thực thể; BMS: Thù lao, Thành viên trong ban giám đốc hoặc ủy ban tư vấn của một thực thể, Tài trợ nghiên cứu; Novartis: Thù lao, Thành viên trong ban giám đốc hoặc ủy ban tư vấn của một thực thể, Tài trợ nghiên cứu; Pfizer: Thù lao, Thành viên trong ban giám đốc hoặc ủy ban tư vấn của một thực thể.
