Phương pháp lột lá trực tiếp cho protoplast cây cau: một hệ thống đơn giản và hiệu quả cho việc tách chiết và chuyển gen protoplast trong cây cau (Areca catechu)

Springer Science and Business Media LLC
Yaodi Wang1, Linxi Wang1, Hongjun Liu1, Bei Gou1, Weiyao Hu1, Qin Li1, Wei Shen2, Aiming Wang3, Hongguang Cui1, Zhaoji Dai1
1Sanya Nanfan Research Institute, Key Laboratory of Green Prevention and Control of Tropical Plant Diseases and Pests (Ministry of Education), School of Plant Protection, Hainan University, Haikou, China
2Key Laboratory of Biology and Genetic Resources of Tropical Crops, Ministry of Agriculture and Rural Affairs & Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Haikou, China
3London Research and Development Centre, Agriculture and Agri-Food Canada, London, Canada

Tóm tắt

Tóm tắt Giới thiệu Cây cau (Areca catechu) là một loại cây gỗ lâu năm có cả giá trị kinh tế và dược liệu, được trồng ở các vùng khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới. Tuy nhiên, việc nghiên cứu sinh học phân tử trên cây cau bị cản trở nghiêm trọng do thiếu phương pháp chuyển gen hiệu quả. Một hệ thống tách chiết và chuyển gen protoplast hiệu quả sẽ rất được mong đợi để vượt qua rào cản này. Kết quả Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã mô tả một phương pháp đơn giản và hiệu quả để tách chiết và chuyển gen protoplast từ cây cau lâu năm. Một lượng lớn protoplast (2.5 × 107 protoplast trên mỗi gam mô lá tươi) đã được thu được từ các lá xanh nhạt mới nổi được tiêu hóa qua đêm trong dung dịch enzyme [2% (w/v) cellulase R10, 0.5% (w/v) macerozyme R10, 0.7 M mannitol, 10 mM CaCl2, 20 mM KCl, 20 mM MES và 0.1% (w/v) BSA, pH 5.7] bằng phương pháp lột lá trực tiếp. Các protoplast cây cau được tách chiết giữ được độ sống 86.6% và đã được chuyển gen thành công với plasmid có gắn protein huỳnh quang xanh (GFP) (pGreen0029-GFP, 6.0 kb) thông qua phương pháp chuyển gen trung gian polyethylene glycol (PEG). Hơn nữa, nồng độ mannitol (tối ưu: 0.7 M) đã được xác định là yếu tố chính ảnh hưởng đến việc tách chiết protoplast cây cau. Chúng tôi cũng đã chứng minh rằng mật độ tối ưu của protoplast cây cau cho sự chuyển gen hiệu quả là từ 1.0 đến 1.5 × 106 tế bào/ml. Với sự tối ưu hóa các tham số chuyển gen, chúng tôi đã đạt được hiệu quả chuyển gen tương đối cao gần 50%. Kết luận Chúng tôi đã thiết lập được protocol đầu tiên hiệu quả cho việc tách chiết và chuyển gen protoplast cây cau với sản lượng cao. Phương pháp này sẽ được áp dụng trong các nghiên cứu sinh học khác nhau của cây cau, như phân tích chức năng gen, chỉnh sửa hệ gen, vận chuyển và định vị protein cũng như tương tác giữa các protein. Ngoài ra, hệ thống protoplast cung cấp một phương pháp chuyển gen tuyệt vời cho cây gỗ lâu năm - cây cau. Hơn nữa, nền tảng đã thiết lập có thể được áp dụng trong việc tách chiết và chuyển gen protoplast cho các loài quan trọng khác trong họ cau, bao gồm cả cọ dầu và dừa.

Từ khóa


Tài liệu tham khảo

Manimekalai R, Nair S, Naganeeswaran A, Karun A, Malhotra S, Hubbali V. Transcriptome sequencing and de novo assembly in arecanut, Areca catechu L elucidates the secondary metabolite pathway genes. Biotechnol Rep. 2018;17:63–9.

Yang Y, Huang L, Xu C, Qi L, Wu Z, Li J, et al. Chromosome-scale genome assembly of areca palm (Areca catechu). Mol Ecol Resour. 2021;21:2504–19.

Peng W, Liu YJ, Wu N, Sun T, He XY, Gao YX, et al. Areca catechu L. (Arecaceae): a review of its traditional uses, botany, phytochemistry, pharmacology and toxicology. J Ethnopharmacol. 2015;164:340–56.

Zhou G, Yin H, Chen F, Wang Y, Gao Q, Yang F, et al. The genome of Areca catechu provides insights into sex determination of monoecious plants. New Phytol. 2022;236:2327.

Yang K, Shen W, Li Y, Li Z, Miao W, Wang A, et al. Areca palm necrotic ringspot virus, classified within a recently proposed genus Arepavirus of the family Potyviridae, is associated with necrotic ringspot disease in areca palm. Phytopathology. 2019;109:887–94.

Wang Y, Shen W, Dai Z, Gou B, Liu H, Hu W, et al. Biological and molecular characterization of two closely-related arepaviruses and their antagonistic interaction in Nicotiana benthamiana. Front Microbiol. 2021;12: 755156.

An Q, Cui C, Muhammad Khan N, Zhou G, Wan Y. Genome-wide investigation of ZINC-IRON PERMEASE (ZIP) genes in Areca catechu and potential roles of ZIPs in Fe and Zn uptake and transport. Plant Signal Behav. 2021;16:1995647.

Pitzschke A, Persak H. Poinsettia protoplasts-a simple, robust and efficient system for transient gene expression studies. Plant Methods. 2012;8:14.

Davey MR, Anthony P, Power JB, Lowe KC. Plant protoplasts: status and biotechnological perspectives. Biotechnol Adv. 2005;23:131–71.

Masani MY, Noll GA, Parveez GK, Sambanthamurthi R, Prüfer D. Efficient transformation of oil palm protoplasts by PEG-mediated transfection and DNA microinjection. PLoS ONE. 2014;9: e96831.

Masani MY, Parveez GK, Noll G, Fizree MD, Sambanthamurthi R, Pruefer D. Protoplast Isolation and Transformation in Oil Palm. Methods Mol Biol. 2022;2464:187–202.

Dai Z, Wang A. Isolation and transfection of plant mesophyll protoplasts for virology research. Methods Mol Biol. 2022;2400:43–53.

Priyadarshani SV, Hu B, Li W, Ali H, Jia H, Zhao L, et al. Simple protoplast isolation system for gene expression and protein interaction studies in pineapple (Ananas comosus L.). Plant Methods. 2018;14:95.

Yoo SD, Cho YH, Sheen J. Arabidopsis mesophyll protoplasts: a versatile cell system for transient gene expression analysis. Nat Protoc. 2007;2:1565–72.

Wu FH, Shen SC, Lee LY, Lee SH, Chan MT, Lin CS. Tape-Arabidopsis sandwich-a simpler Arabidopsis protoplast isolation method. Plant Methods. 2009;5:16.

Mathur J, Koncz C. PEG-mediated protoplast transformation with naked DNA. Methods Mol Biol. 1998;82:267–76.

Yu G, Cheng Q, Xie Z, Xu B, Huang B, Zhao B. An efficient protocol for perennial ryegrass mesophyll protoplast isolation and transformation, and its application on interaction study between LpNOL and LpNYC1. Plant Methods. 2017;13:46.

Masani MY, Noll G, Parveez GK, Sambanthamurthi R, Prüfer D. Regeneration of viable oil palm plants from protoplasts by optimizing media components, growth regulators and cultivation procedures. Plant Sci. 2013;210:118–27.

Zhang Y, Su J, Duan S, Ao Y, Dai J, Liu J, et al. A highly efficient rice green tissue protoplast system for transient gene expression and studying light/chloroplast-related processes. Plant Methods. 2011;7(1):30.

Sultana MS, Frazier TP, Millwood RJ, Lenaghan SC, Stewart CN Jr. Development and validation of a novel and robust cell culture system in soybean (Glycine max (L.) Merr.) for promoter screening. Plant Cell Rep. 2019;38(10):1329–45.

Gentzel IN, Park CH, Bellizzi M, Xiao G, Gadhave KR, Murphree C, et al. A CRISPR/dCas9 toolkit for functional analysis of maize genes. Plant Methods. 2020;16:133.

Wang H, Chen J, Wu S, Lin M, Chang W. Plant regeneration through somatic embryogenesis from zygotic embryo-derived callus of Areca catechu L. (Arecaceae). In Vitro Cell Dev Biol Plant. 2003;39(1):34–6.

Wang H, Chen J, Chang W. Somatic embryogenesis and plant regeneration from leaf, root and stem-derived callus cultures of Areca catechu. Biol Plant. 2006;50(2):279–82.

Bass A, Hughes W. Conditions for isolation and regeneration of viable protoplasts of oil palm (Elaeis guineensis). Plant Cell Rep. 1984;3(5):169–71.

Hellens RP, Edwards EA, Leyland NR, Bean S, Mullineaux PM. pGreen: a versatile and flexible binary Ti vector for Agrobacterium-mediated plant transformation. Plant Mol Biol. 2000;42:819–32.

Thông tin
Thông tin xuất bản

Springer Science and Business Media LLC

Thông tin tác giả