Nội dung được dịch bởi AI, chỉ mang tính chất tham khảo
Phát triển phương pháp RT-PCR thời gian thực để phát hiện virus parechovirus ở người
Tóm tắt
Các virus parechovirus (PeV-As), thuộc một giống mới trong họ Picornaviridae, đã được liên kết với nhiều vụ bùng phát bệnh nghiêm trọng tại địa phương, chẳng hạn như sổ mũi, viêm phổi, phát ban dạng sẩn và viêm kết mạc. Tuy nhiên, theo như chúng tôi biết, chỉ có một số ít phòng thí nghiệm toàn cầu tiến hành các xét nghiệm để xác định nhóm virus này. Do đó, trong nghiên cứu này, chúng tôi nhằm phát triển và xác thực một phương pháp RT-PCR thời gian thực để nhận diện PeV-As. Để thiết kế và xác thực một mồi – đầu dò PCR thời gian thực nhắm vào vùng 5′-UTR của PeV-As, chúng tôi đã căn chỉnh các trình tự 5′-UTR của PeV-As có sẵn trong GenBank bằng cách sử dụng thuật toán MUSCLE trong MEGA v7.0. Sau đó, vùng 5′-UTR được bảo tồn cao đã được chọn và trình tự mồi – đầu dò của nó được thiết kế bằng cách sử dụng Primer Premier v5.0. Trình tự mồi – đầu dò này sau đó được đánh giá về độ đặc hiệu, tính nhạy và độ lặp lại, và để xác thực, nó được thử nghiệm trên các mẫu phân của 728 trẻ em khỏe mạnh sống tại Bắc Kinh (Trung Quốc). Phương pháp RT-PCR thời gian thực PeV-A chỉ phát hiện các tiêu chuẩn dương tính RNA của các kiểu gene PeV-A (1-8, 14, 17 và 18), trong khi 72 serotype của các virus EV không phải PeV-A không được phát hiện. Thêm vào đó, vùng VP1 của 11 kiểu gene PeV-A này đã thử nghiệm dương tính được khuếch đại bằng các mồi được thiết kế trong nghiên cứu này. Kết quả phân loại cho thấy tám, một và hai chủng trong số 11 là PeV-A1, PeV-A4 và PeV-A6, tương ứng. Chúng tôi cũng đã xác định và trình bày các kết quả đặc trưng di truyền và phân tích hệ gen tương ứng với các trình tự vùng VP1 này. Hơn nữa, phương pháp RT-PCR thời gian thực cho thấy độ nhạy tốt với LOD là 102 bản sao/μL. Kết quả dương tính trong tám thử nghiệm song song ở mỗi gradient nồng độ từ 107 bản sao/μL đến 102 bản sao/μL, cho thấy độ lặp lại tốt. Những phát hiện của chúng tôi cho thấy phương pháp RT-PCR thời gian thực phát triển trong nghiên cứu này có thể được áp dụng để nhận diện PeV-A trong các trường hợp thường xuyên. Chúng tôi đã phát hiện các kiểu gene PeV-A1, 4 và 6 trong 728 mẫu phân bằng phương pháp này. Ngoài ra, chúng tôi tin rằng kết quả của chúng tôi sẽ tạo nền tảng cho các nghiên cứu tiếp theo về PeV-As và tạo điều kiện mở rộng thông tin trình tự gene có sẵn trong GenBank.
Từ khóa
#parechoviruses #PeV-As #RT-PCR #Picornaviridae #genotyping #genetic characterizationTài liệu tham khảo
Tang JW, Bendig JW, Ossuetta I. Vertical transmission of human echovirus 11 at the time of Bornholm disease in late pregnancy. Pediatr Infect Dis J. 2005;24(1):88–9.
Grist NR, Bell EJ, Assaad FJPMV. Enteroviruses in human disease. Prog Med Virol. 1978;24:114–57.
Khatami A, McMullan BJ, Webber M, Stewart P, Francis S, Timmers KJ, et al. Sepsis-like disease in infants due to human parechovirus type 3 during an outbreak in Australia. Clin Infect Dis. 2015;60(2):228–36.
Mizuta K, Yamakawa T, Nagasawa H, Itagaki T, Katsushima F, Katsushima Y, et al. Epidemic myalgia associated with human parechovirus type 3 infection among adults occurs during an outbreak among children: findings from Yamagata, Japan, in 2011. J Clin Virol. 2013;58(1):188–93.
Arola A, Santti J, Ruuskanen O, Halonen P, Hyypiä T. Identification of enteroviruses in clinical specimens by competitive PCR followed by genetic typing using sequence analysis. J Clin Microbiol. 1996;34(2):313–8.
Chapman NM, Tracy S, Gauntt CJ, Fortmueller U. Molecular detection and identification of enteroviruses using enzymatic amplification and nucleic acid hybridization. J Clin Microbiol. 1990;28(5):843–50.
Hyypiä T, Auvinen P, Maaronen M. Polymerase chain reaction for human picornaviruses. J Gen Virol. 1989;70(Pt 12):3261–8.
Olive DM, Al-Mufti S, Al-Mulla W, Khan MA, Pasca A, Stanway G, et al. Detection and differentiation of picornaviruses in clinical samples following genomic amplification. J Gen Virol. 1990;71(Pt 9):2141–7.
Zoll GJ, Melchers WJ, Kopecka H, Jambroes G, van der Poel HJ, Galama JM. General primer-mediated polymerase chain reaction for detection of enteroviruses: application for diagnostic routine and persistent infections. J Clin Microbiol. 1992;30(1):160–5.
Hyypiä T, Horsnell C, Maaronen M, Khan M, Kalkkinen N, Auvinen P, et al. A distinct picornavirus group identified by sequence analysis. Proc Natl Acad Sci USA. 1992;89(18):8847–51.
Wigand R, Sabin AB. Properties of ECHO types 22, 23 and 24 viruses. Arch Gesamte Virusforsch. 1961;11:224–47.
Ghazi F, Hughes PJ, Hyypiä T, Stanway G. Molecular analysis of human parechovirus type 2 (formerly echovirus 23). J Gen Virol. 1998;79(Pt 11):2641–50.
Esposito S, Rahamat-Langendoen J, Ascolese B, Senatore L, Castellazzi L, Niesters HGM. Pediatric parechovirus infections. J Clin Virol. 2014;60(2):84–9.
Oberste MS, Maher K, Kilpatrick DR, Flemister MR, Brown BA, Pallansch MA. Typing of human enteroviruses by partial sequencing of VP1. J Clin Microbiol. 1999;37(5):1288–93.
Oberste MS, Maher K, Flemister MR, Marchetti G, Kilpatrick DR, Pallansch MA. Comparison of classic and molecular approaches for the identification of untypeable enteroviruses. J Clin Microbiol. 2000;38(3):1170–4.
Kumar S, Stecher G, Tamura K. MEGA7: molecular evolutionary genetics analysis version 7.0 for bigger datasets. Mol Biol Evol. 2016;33(7):1870–4.
Allan W, Nix, Kaija, Maher, Susanne E, Johansson, et al. Detection of all known parechoviruses by real-time PCR. 2008.
Kroneman A, Vennema H, Deforche K, v d Avoort H, Peñaranda S, Oberste MS, et al. An automated genotyping tool for enteroviruses and noroviruses. Journal of clinical virology : the official publication of the Pan American Society for Clinical Virology. 2011;51(2):121–5.
Hall TA. BioEdit : a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT. Nucl Acids Symp Ser. 1999.
Stamatakis A. RAxML version 8: a tool for phylogenetic analysis and post-analysis of large phylogenies. Bioinformatics (Oxford, England). 2014;30(9):1312–3.
Ljubin-Sternak S, Juretić E, Šantak M, Pleša M, Forčić D, Vilibić-Čavlek T, et al. Clinical and molecular characterization of a parechovirus type 1 outbreak in neonates in Croatia. J Med Virol. 2011;83(1):137–41.
Ehrnst A, Eriksson M. Epidemiological features of type 22 echovirus infection. Scand J Infect Dis. 1993;25(3):275–81.