Cécile Bally1, Aline Renneville2, Lionel Adès3, Claude Preudhomme2, Hugues de Thé4, Pierre Fenaux3, Jacqueline Lehmann-Che5
1Hématologie séniors, Hôpital Saint Louis, APHP, Paris, France
2Lille University Hospital, Lille, France
3Hôpital St Louis, Université Paris 7, Paris, France
4Université Paris Diderot / CNRS UMR7212 / INSERM U944, Paris, France
5Hopital Saint-Louis, Paris, France
Tóm tắt
Tóm tắt
Nền tảng
Những đột biến TP53 làm bất hoạt protein p53, thường liên quan đến sự mất allele TP53 còn lại thông qua sự xóa đoạn 17p, là những yếu tố tiên lượng chính trong nhiều bệnh lý huyết học, bao gồm CLL, u tủy, AML và MDS. Trong AML và MDS, chúng thường liên quan đến kiểu hình nhiễm sắc thể phức tạp (bao gồm xóa đoạn 17p) và tiên lượng rất kém (Blood 1991, 78(7):1652-7, Bejar, NEJM 2011), bao gồm cả sau ghép tế bào gốc allogeneic (Middeke JM, Blood 2014), nhưng chúng cũng xuất hiện trong MDS nguy cơ thấp với xóa đoạn 5q đơn lẻ, nơi chúng mang lại khả năng kháng Lenalidomide (Jadersten, JCO 2011). Sự xuất hiện của các kỹ thuật Giải trình tự thế hệ mới (NGS) đã cải thiện việc phát hiện những đột biến này, cho phép xác định các ổ đột biến nhỏ. Các phương pháp phát hiện khác cũng có thể thú vị, đặc biệt là các phương pháp chức năng như FASAY (Phép thử chức năng của allele tách biệt trong nấm men), một phương pháp đơn giản và nhạy để phát hiện đột biến TP53 bằng cách đánh giá chức năng p53 như một yếu tố phiên mã (Flaman et al, PNAS 1995). Chúng tôi đã so sánh việc phát hiện đột biến TP53 trong MDS và AML bằng phương pháp FASAY và NGS.
Phương pháp
Theo dõi 84 bệnh nhân đã phân tích, bao gồm 10 bệnh nhân AML, 10 bệnh nhân MDS nguy cơ cao, và 64 bệnh nhân MDS nguy cơ thấp với xóa đoạn 5q. RNA và DNA được trích xuất từ tế bào đơn nhân tủy. Đột biến TP53 được phát hiện trên RNA thông qua FASAY, trong đó, sau khi khuếch đại RNA TP53, sản phẩm PCR được đồng chuyển với một plasmid sửa chữa khoảng trống mở, dẫn tới việc biểu hiện protein p53 trong nấm men thông qua quá trình tái tổ hợp tương đồng. Chủng nấm men sử dụng phụ thuộc vào khả năng chức năng của p53 để phát triển và màu sắc, phát hiện hơn 10% thuộc địa nấm men đỏ nhỏ định nghĩa kết quả FASAY không chức năng. Tất cả các FASAY không chức năng được xác nhận bằng các phiên bản tách biệt của thử nghiệm và các thiếu sót TP53 được phân loại bằng giải trình tự Sanger. Giới hạn phát hiện khoảng 10% trong thực tế của chúng tôi (Manie E, Cancer Res 2009). Song song, các đột biến TP53 được phát hiện trên DNA bằng NGS sử dụng thiết kế đĩa IRON II và pyrosequencing trên hệ thống GS Junior (Roche). (Kohlmann, Leukemia 2011). FASAY (+giải trình tự Sanger) và NGS được thực hiện tại hai phòng thí nghiệm khác nhau.
Hasil
Theo FASAY, 47 bệnh nhân (56%) có p53 chức năng và 37 trường hợp (44%) có p53 không chức năng, và đột biến đã được xác nhận bằng Sanger trong tất cả các trường hợp không chức năng.
Theo phân tích NGS, không có đột biến TP53 nào được tìm thấy ở 47 trường hợp (56%) và một đột biến được phát hiện ở 37 trường hợp (44%).
Trong số 37 trường hợp bị đột biến theo NGS, tỷ lệ allele bị đột biến trung bình là 35% (phạm vi từ 3% đến 99%), bao gồm tỷ lệ trung bình 72%, 35%, 25% trong AML, MDS nguy cơ cao và MDS nguy cơ thấp với xóa đoạn 5q, tương ứng. Kích thước clone đột biến nhỏ hơn 10% chỉ có ở 2 bệnh nhân, những người này đều có MDS nguy cơ thấp với xóa đoạn 5q (3% và 6%, tương ứng).
Có sự tương quan hoàn hảo giữa FASAY và NGS được tìm thấy trong 80 (95,5%) trường hợp. 4 trường hợp không đồng nhất bao gồm một đột biến chỉ được phát hiện bởi FASAY trong 2 trường hợp và chỉ được phát hiện bởi NGS trong 2 trường hợp. Những đột biến không được phát hiện bởi NGS là các chèn của các trình tự intron (intron 9) không được khám phá bởi kỹ thuật đã sử dụng. Những chèn này dẫn tới protein không chức năng được phát hiện tốt bởi FASAY, phân tích toàn bộ trình tự cDNA bao gồm các khiếm khuyết cắt nối. Những đột biến không được phát hiện bởi FASAY là những đột biến mà tỷ lệ các allele bị đột biến nhỏ hơn 10% (3% và 6% tương ứng).
Cuối cùng, trong khi chi phí phân tích NGS cho đột biến TP53 khoảng 200 euro khi thực hiện một mình (và khoảng 2000 euro khi kết hợp với phân tích của 30 gen chính khác liên quan đến MDS và AML), chi phí của kỹ thuật FASAY khoảng 20 euro (giá chỉ bao gồm hóa chất).
Kết luận
Kỹ thuật FASAY là một phương pháp rẻ tiền, mặc dù có độ nhạy chỉ 10%, đã có khả năng phát hiện 98% đột biến TP53 được phát hiện bởi NGS. Trên thực tế, những đột biến này dường như liên quan đến các clone tương đối lớn trong MDS và AML. FASAY cũng có thể phát hiện 2 đột biến intron không điển hình mà NGS đã bỏ qua. Chứng minh trong những trường hợp khó khăn như vậy rằng protein p53 kết quả là không chức năng và do đó có thể có ý nghĩa sinh lý bệnh là một lợi thế của FASAY. Sự kết hợp của hai phương pháp, đặc biệt là sự kết hợp giữa phân tích DNA và RNA, có thể hữu ích trong những trường hợp như vậy.
Các tuyên bố công khai
Không có xung đột lợi ích nào liên quan để tuyên bố.
