Phát hiện virus đốm xanh dưa chuột trong hạt cây nhiễm virus với nồng độ thấp bằng phương pháp RT-qPCR cải tiến một bước trước khuếch đại

Plant Methods - Tập 18 - Trang 1-10 - 2022
Yin Xinying1, Li Xin2, Yang Lili1, Zheng Qiuyue1, Piao Yongzhe1, Cao Jijuan1
1Key Laboratory of Biotechnology and Bioresources Utilization of Ministry of Education, Dalian Minzu University, Dalian, China
2Dalian Customs Technology Center, Dalian, China

Tóm tắt

Hạt giống là môi trường quan trọng cho việc truyền tải virus thực vật ở khoảng cách xa. Do đó, việc phát triển các phương pháp phát hiện nhạy cảm hơn cho việc phát hiện nồng độ virus nhiễm bệnh thấp trong hạt giống là rất cần thiết nhằm đảm bảo chất lượng lô hạt giống. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã phát triển một phương pháp RT-qPCR (phản ứng chuỗi polymerase phiên mã ngược định lượng) một bước trước khuếch đại dựa trên công nghệ TaqMan để phát hiện virus đốm xanh dưa chuột (CGMMV) trong hạt giống bí. Các mẫu bột hạt đã được chuẩn bị với nồng độ thấp của CGMMV được mô phỏng (tỷ lệ khối lượng 1:900 và 1:1000), và tính đồng nhất của chúng đã được xác nhận bằng phương pháp RT-qPCR một bước trước khuếch đại. Chúng tôi đã sử dụng RT-qPCR một bước trước khuếch đại để phát hiện CGMMV trong các hạt giống nhiễm virus với nồng độ thấp và so sánh phương pháp này với RT-qPCR toàn diện và phương pháp enzyme liên kết miễn dịch sandwich hai kháng thể (DAS–ELISA), các phương pháp chính được sử dụng để phát hiện virus trong hạt giống. Giới hạn phát hiện tối thiểu (LOD) của các phương pháp RT-qPCR một bước trước khuếch đại cải tiến cho các hạt giống nhiễm CGMMV mô phỏng trong các mẫu hạt giống lớn là 0.1%. Các phương pháp RT-qPCR một bước trước khuếch đại có thể phát hiện đáng tin cậy và ổn định một hạt giống nhiễm CGMMV trong 1000 hạt giống và cho thấy độ nhạy phát hiện cao hơn so với RT-qPCR toàn diện (hạt nhiễm so với hạt khỏe 1:900) và phương pháp DAS–ELISA (hạt nhiễm so với hạt khỏe 1:500). Phương pháp RT-qPCR một bước trước khuếch đại cải tiến của chúng tôi đã chứng minh là rất phù hợp cho việc phân tích các lô hạt giống lớn.

Từ khóa

#CGMMV #RT-qPCR #hạt giống #phát hiện virus #enzyme liên kết miễn dịch

Tài liệu tham khảo

Johansen E, Edwards MC, Hampton RO. Seed transmission of viruses: current perspectives. Annu Rev Phytopathol. 1994;32:363–86. Ali A, Kobayashi M. Seed transmission of cucumber mosaic virus in pepper. J Virol Methods. 2010;163:234–7. Dombrovsky A, Tran-Nguyen LTT, Jones RAC. Cucumber green mottle mosaic virus: rapidly increasing global distribution, etiology, epidemiology, and management. Annu Rev Phytopathol. 2017;55:231–56. Torre C, Aguero J, Gomez-Aix C, Aranda MA. Comparison of DAS-ELISA and qRT-PCR for the detection of cucurbit viruses in seeds. Ann Appl Biol. 2019;176(2):158–69. Sastry KS. Seed-borne plant virus diseases. New delhi: Springer; 2013. https://doi.org/10.1007/978-81-322-0813-6. Sui X, Li R, Shamimuzzaman M, Wu Z, Ling KS. Understanding the transmissibility of cucumber green mottle mosaic virus in watermelon seeds and seed health assays. Plant Dis. 2019;103(6):1126–31. Liu HW, Luo LX, Li JQ, Liu PF, Chen XY, Hao JJ. Pollen and seed transmission of cucumber green mottle mosaic virus in cucumber. Plant Pathol. 2014;63(1):72–7. Ling KS, Wechter WP, Jordan R. Development of a one-step immunocapture real-time TaqMan RT-PCR assay for the broad spectrum detection of Pepino mosaic virus. J Virol Methods. 2007;144(1–2):65–72. Zhang Y, Zhao W, Li M, Chen H, Zhu S, Fan Z. Real-time TaqMan RT-PCR for detection of maize chlorotic mottle virus in maize seeds. J Virol Methods. 2011;171(1):292–4. Mumford R, Boonham N, Tomlinson J, Barker I. Advances in molecular phytodiagnostics—new solutions for old problems. Eur J Plant Pathol. 2006;116(1):1–19. Kuan CP, Huang HC, Chang CC, Lu YL. TaqMan real-time PCR for detection and quantitation of squash leaf curl virus in cucurbits. J Virol Methods. 2012;179(2):367–72. Huo P, Shen WT, Yan P, Tuo DC, Li XY, Zhou P. Simultaneous detection of papaya ringspot virus, papaya leaf distortion mosaic virus, and papaya mosaic virus by multiplex real-time reverse transcription PCR. Acta Virol. 2015;59(4):380–8. Abrahamian PE, Seblani R, Sobh H, Abou-Jawdah Y. Detection and quantitation of two cucurbit criniviruses in mixed infection by real-time RT-PCR. J Virol Methods. 2013;193(2):320–6. Chen HY, Zhao WJ, Gu QS, Chen Q, Lin SM, Zhu SF. Real time TaqMan RT-PCR assay for the detection of cucumber green mottle mosaic virus. J Virol Methods. 2008;149(2):326–9. Phytosanitary requirements for imported tomato and pepper seeds, G/SPS/N/CHN/1223. In: Bulletin of the Committee on sanitary and phytosanitary measures, 21–5663. World Trade Organization. 16 Jul 2021. Lecoq H, Katis N. Control of cucurbit viruses. Adv Virus Res. 2014;90:255–96. ISTA. Chapter 7: Validated seed health testing methods. 7-026: Detection of Squash mosaic virus, Cucumber green mottle mosaic virus and Melon necrotic spot virus in cucurbit seed. In: International rules for seed testing (p. 7–026-1–7-026-11). Bassersdorf, Switzerland: Interna tional Seed Testing Association (ISTA). Darzi E, Lachman O, Smith E, Koren A, Klein E, Pass N, Frenkel O, Dombrovsky A. Paths of cucumber green mottle mosaic virus disease spread and disinfectant based management. Ann Appl Biol. 2020;117(3):374–84. Sun YY, Niu XW, Cui D, Fan M. High-throughput sequencing reveals vsiRNAs derived from cucumber green mottle mosaic virus-infected watermelon. Hortic Plant J. 2017;3(1):17–22. Ali A, Natsuaki T, Okuda S. Identification and molecular characterization of viruses infecting cucurbits in Pakistan. J Phytopathology. 2004;152(11–12):677–82. Jiao YB, Jiang JY, Wu YH, Xia ZH. Rapid detection of Cucumber green mottle mosaic virus in watermelon through a recombinase polymerase amplification assay. J Virol Methods. 2019;270:146–9. Zheng HY, Xiao CL, Han KL, Peng JJ, Lin L, Lu YW, Xie L, Wu XH, Xu P, Li GJ, Chen JP, Yan F. Development of an agroinoculation system for full-length and GFP-tagged cDNA clones of cucumber green mottle mosaic virus. Arch Virol. 2015;160(11):2867–72. Li JX, Liu SS, Gu QS. Transmission efficiency of cucumber green mottle mosaic virus via seeds, soil, pruning and irrigation water. J Phytopathol. 2016;164(5):300–9. Quarantine and identification method of Cucumber green mottle mosaic virus. In: National standard of the people's Republic of China GB/T28071–2011. Standardization Administration of the P.R.C.. 30 Dec 2011. Quarantine and identification method of melon seed borne virus. In: National standard of the People's Republic of China GB/T 36781–2018. Standardization Administration of the P.R.C.. 17 Sept 2018. Zhu Y, Wang J, Wang C. Research on the preparation, uniformity and stability of mixed standard substance for rapid detection of goat milk composition. Anim Sci J. 2018;89(5):794–801. Reference materials–guidance for characterization and assessment for homogeneity and stability. ISO Guide 35:2017. Statistical methods for use in proficiency testing by interlaboratory comparisons. ISO 13528:2005. Techniques of estimation and tests relating to means and variances.In: Statistical interpretation of data-Part 5. ISO/DIS 16269–5. Chapter 7: Validated seed health testing methods. 7–026: Detection of Squash mosaic virus, Cucumber green mottle mosaic virus and Melon necrotic spot virus in cucurbit seed. In: International rules for seed testing. International Seed Testing Association (ISTA). 2021. Notice on preventing Tomato Brown wrinkle virus from being introduced into tomato and pepper seeds. In: Announcement No. 91 of the General Administration. Customs.P.R.C. 2021. Cowell SJ, Harper SJ, Dawson WO. A real-time RT-qPCR assay for the detection of Citrus tatter leaf virus. J Virol Methods. 2017;244:29–31. Bruisson S, Lebel S, Walter B, Prevotat L, Seddas S, Schellenbaum P. Comparative detection of a large population of grapevine viruses by TaqMan® RT-qPCR and ELISA. J Virol Methods. 2017;240:73–7.
Thông tin
Thông tin xuất bản

Plant Methods

Tập 18

1-10

Thông tin tác giả