Nội dung được dịch bởi AI, chỉ mang tính chất tham khảo
Giới hạn phát hiện của một số enzyme phiên mã ngược thương mại: tác động đến các mức độ transcript thấp và cao được đánh giá bằng RT-PCR định lượng
Tóm tắt
Trong di truyền học chức năng, việc đo lường transcript là điều vô cùng quan trọng. Các xét nghiệm phản ứng chuỗi polymerase phiên mã ngược định lượng (qRT-PCR) là công nghệ phổ biến nhất và phụ thuộc vào bước phân tử ban đầu, là phiên mã ngược (RT). Nghiên cứu này cung cấp cái nhìn tổng quát về ảnh hưởng của các yếu tố như hệ thống RT, lượng RNA nền và sự phong phú của transcript đối với hiệu suất của qRT-PCR. Bằng cách sử dụng qRT-PCR, chúng tôi đã so sánh hiệu suất của một số hệ thống RT thường được sử dụng và đo lường sự sản xuất các sản phẩm có thể khuếch đại bằng PCR cũng như ảnh hưởng của các chất ức chế PCR. Các xét nghiệm qRT-PCR đã được thực hiện bằng hệ thống TaqMan, mặc dù chúng tôi cũng đã kiểm tra hóa học SYBR Green I, hóa chất không tương thích với tất cả các hệ thống RT. Khi xử lý với các transcript có số lượng thấp, hệ thống SuperScript II tạo ra nhiều phân tử có thể phát hiện hơn so với bốn hệ thống khác được thử nghiệm: Sensiscript, Omniscript, SuperScript III và PowerScript (P < 0.05). Tuy nhiên, các hệ thống Sensiscript và PowerScript lại hiệu quả hơn trong việc phát hiện các transcript có số lượng cao trong điều kiện có 1 đến 2 μg RNA nền (P < 0.05). Khía cạnh nổi bật nhất là ảnh hưởng của độ pha loãng của phản ứng RT đến PCR tiếp theo. Thực tế, một số ức chế đã giảm đi khi sử dụng các phản ứng RT bị pha loãng cho các phép đo PCR định lượng. Hơn nữa, lượng RNA nền trong phản ứng RT cũng là một yếu tố chính ảnh hưởng đến bước tiếp theo trong qRT-PCR, phản ứng PCR. Trong khi Sensiscript ít bị thiên lệch hơn, các hệ thống khác lại chứa một nguồn ức chế PCR quan trọng, gây cản trở lên đến 70% hiệu suất của qRT-PCR. Nghiên cứu này cung cấp cái nhìn tổng quát về ảnh hưởng của các yếu tố như hệ thống RT, hóa học qRT-PCR, lượng RNA nền và sự phong phú của transcript đến hiệu suất của qRT-PCR. Trong khi yếu tố ảnh hưởng quan trọng nhất là sự hiện diện của các chất ức chế trong các hệ thống RT, RNA nền tổng thể cũng là một thành phần ảnh hưởng chủ yếu đến phản ứng PCR. Bất cứ khi nào mục đích của một nghiên cứu là đạt được một phép đo chính xác về biểu hiện gen hoặc lập hồ sơ transcriptome toàn cầu (ví dụ: vi mảng), bước RT là rất quan trọng và cần được xem xét cẩn thận.
Từ khóa
#RT-PCR #phiên mã ngược #enzyme phiên mã ngược #RNA nền #transcriptTài liệu tham khảo
Livesey FJ: Strategies for microarray analysis of limiting amounts of RNA. Brief Funct Genomic Proteomic 2003, 2: 31-6. 10.1093/bfgp/2.1.31.
Bustin SA: Quantification of mRNA using real-time reverse transcription PCR (RT-PCR): trends and problems. Journal of Molecular Endocrinology 2002, 29: 23-39. 10.1677/jme.0.0290023.
Bustin SA, Benes V, Nolan T, Pfaffl MW: Quantitative real-time RT-PCR–a perspective. Journal of Molecular Endocrinology 2005, 34: 597-601. 10.1677/jme.1.01755.
Cao W, Epstein C, Liu H, DeLoughery C, Ge N, Lin J, Diao R, Cao H, Long F, Zhang X, Chen Y, Wright PS, Busch S, Wenck M, Wong K, Saltzman AG, Tang Z, Liu L, Zilberstein A: Comparing gene discovery from Affymetrix GeneChip microarrays and Clontech PCR-select cDNA subtraction: a case study. BMC Genomics 2004, 5: 26. 10.1186/1471-2164-5-26.
Bui LC, Leandri RD, Renard JP, Duranthon V: SSH adequacy to preimplantation mammalian development: scarce specific transcripts cloning despite irregular normalisation. BMC Genomics 2005, 6: 155. 10.1186/1471-2164-6-155.
Suslov O, Steindler DA: PCR inhibition by reverse transcriptase leads to an overestimation of amplification efficiency. Nucleic Acids Res 2005, 33: e181. 10.1093/nar/gni176.
Larionov A, Krause A, Miller W: A standard curve based method for relative real time PCR data processing. BMC Bioinformatics 2005, 6: 62. 10.1186/1471-2105-6-62.
Wilson IG: Inhibition and facilitation of nucleic acid amplification. Appl Environ Microbiol 1997,63(10):3741-3751.
Rossen L, Norskov P, Holmstrom K, Rasmussen OF: Inhibition of PCR by components of food samples, microbial diagnostic assays and DNA-extraction solutions. International Journal of Food Microbiology 1992, 17: 37-45. 10.1016/0168-1605(92)90017-W.
Curry J, McHale C, Smith MT: Low efficiency of the Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase during reverse transcription of rare t(8;21) fusion gene transcripts. Biotechniques 2002, 32: 768. 770, 772, 754–5
Tichopad A, Didier A, Pfaffl MW: Inhibition of real-time RT-PCR quantification due to tissue-specific contaminants. Molecular and Cellular Probes 2004, 18: 45-50. 10.1016/j.mcp.2003.09.001.
Schmittgen TD, Zakrajsek BA, Mills AG, Gorn V, Singer MJ, Reed MW: Quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction to study mRNA decay: comparison of endpoint and real-time methods. Analytical Biochemistry 2000, 285: 194-204. 10.1006/abio.2000.4753.
Gal AB, Carnwath JW, Dinnyes A, Herrmann D, Niemann H, Wrenzycki C: Comparison of real-time polymerase chain reaction and end-point polymerase chain reaction for the analysis of gene expression in preimplantation embryos. Reproduction, Fertility, and Development 2006, 18: 365-371. 10.1071/RD05012.
Chandler DP, Wagnon CA, Bolton H Jr: Reverse transcriptase (RT) inhibition of PCR at low concentrations of template and its implications for quantitative RT-PCR. Appl Environ Microbiol 1998,64(2):669-677.
Baltimore D: RNA-dependent DNA polymerase in virions of RNA tumour viruses. Nature 1970, 226: 1209-1211. 10.1038/2261209a0.
Temin HM, Mizutani S: RNA-dependent DNA polymerase in virions of Rous sarcoma virus. Nature 1970, 226: 1211-3. 10.1038/2261211a0.
Spiegelman S, Burny A, Das MR, Keydar J, Schlom J, Travnicek M, Watson K: DNA-directed DNA polymerase activity in oncogenic RNA viruses. Nature 1970, 227: 1029-31. 10.1038/2271029a0.
Gao G, Orlova M, Georgiadis MM, Hendrickson WA, Goff SP: Conferring RNA polymerase activity to a DNA polymerase: a single residue in reverse transcriptase controls substrate selection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 1997, 94: 407-11. 10.1073/pnas.94.2.407.
Fisher TS, Darden T, Prasad VR: Mutations proximal to the minor groove-binding track of human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase differentially affect utilization of RNA versus DNA as template. Journal of Virology 2003, 77: 5837-45. 10.1128/JVI.77.10.5837-5845.2003.
Potter J, Zheng W, Lee J: Thermal stability and cDNA synthesis capability of SuperScript III reverse transcriptase. Focus 2003, 25.1: 19-24.
Chen D, Patton JT: Reverse transcriptase adds nontemplated nucleotides to cDNAs during 5'-RACE and primer extension. Biotechniques 2001, 30: 574-80. 582
Nycz CM, Dean CH, Haaland PD, Spargo CA, Walker GT: Quantitative reverse transcription strand displacement amplification: quantitation of nucleic acids using an isothermal amplification technique. Analytical Biochemistry 1998, 259: 226-234. 10.1006/abio.1998.2641.
Nadeau JG, Pitner JB, Linn CP, Schram JL, Dean CH, Nycz CM: Real-time, sequence-specific detection of nucleic acids during strand displacement amplification. Analytical Biochemistry 1999, 276: 177-187. 10.1006/abio.1999.4350.
Sellner LN, Coelen RJ, Mackenzie JS: Reverse transcriptase inhibits Taq polymerase activity. Nucleic Acids Res 1992, 20: 1487-1490. 10.1093/nar/20.7.1487.
Karsai A, Muller S, Platz S, Hauser MT: Evaluation of a homemade SYBR green I reaction mixture for real-time PCR quantification of gene expression. Biotechniques 2002, 32: 790-2. 794–6
Chumakov KM: Reverse transcriptase can inhibit PCR and stimulate primer-dimer formation. PCR Methods Appl 1994,4(1):62-64.
Hietala SK, Crossley BM: Armored RNA as virus surrogate in a real-time reverse transcriptase PCR assay proficiency panel. Journal of Clinical Microbiology 2006, 44: 67-70. 10.1128/JCM.44.1.67-70.2006.
Bustin SA, Nolan T: Pitfalls of quantitative real-time reverse-transcription polymerase chain reaction. J Biomol Tech 2004, 15: 155-166.
Max N, Willhauck M, Wolf K, Thilo F, Reinhold U, Pawlita M, Thiel E, Keilholz U: Reliability of PCR-based detection of occult tumour cells: lessons from real-time RT-PCR. Melanoma Research 2001, 11: 371-378. 10.1097/00008390-200108000-00007.
Karrer EE, Lincoln JE, Hogenhout S, Bennett AB, Bostock RM, Martineau B, Lucas WJ, Gilchrist DG, Alexander D: In situ isolation of mRNA from individual plant cells: creation of cell-specific cDNA libraries. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 1995, 92: 3814-3818. 10.1073/pnas.92.9.3814.
National Center for Biotechnology Information (NCBI)[http://www.ncbi.nlm.nih.gov]
Heid CA, Stevens J, Livak KJ, Williams PM: Real time quantitative PCR. Genome Research 1996, 6: 986-994. 10.1101/gr.6.10.986.
Morrison TB, Weis JJ, Wittwer CT: Quantification of low-copy transcripts by continuous SYBR Green I monitoring during amplification. Biotechniques 1998, 24: 954-8. 960, 962
Applied Biosystems[http://www.appliedbiosystems.com/support/tutorials/pdf/data_analysis_7700.pdf]
Clontech: Aids to DNA synthesis, repair, amplification and the rest: Powerscript. Nature 2000, 405: 255. 10.1038/35012142.