Hans Jiro Jiro Becker1, Masatoshi Sakurai2, Satoshi Yamazaki1,3
1Institute of Medical Science, Division of Stem Cell Biology, The University of Tokyo, Tokyo, Japan
2Division of Hematology, Department of Medicine, Keio University School of Medicine, Tokyo, Japan
3Laboratory of Stem Cell Therapy, Faculty of Medicine, University of Tsukuba, Ibaraki, Japan
Tóm tắt
Đặt vấn đề
Việc áp dụng chỉnh sửa gene trong các tế bào gốc huyết học (HSCs) mang lại tiềm năng lớn cho việc điều trị các rối loạn gen huyết học như suy giảm miễn dịch phối hợp nặng (SCID). Tuy nhiên, một điểm nghẽn quan trọng là các HSC đã chỉnh sửa không thể dễ dàng được mở rộng ngoài cơ thể mà không làm mất khả năng tự làm mới của chúng. Hạn chế này loại trừ khả năng phát triển các HSC hoạt động từ các tế bào đơn lẻ, điều này sẽ cho phép lựa chọn các dòng mong muốn dựa trên việc xác minh trình tự của các sửa đổi mục tiêu và không mục tiêu liên quan. Gần đây, chúng tôi đã báo cáo về một giao thức nuôi cấy dựa trên polymer không có huyết thanh giúp chọn lọc sự phát triển in vitro của các HSC murine [1]. Trong nghiên cứu hiện tại, chúng tôi đã nhằm mục đích mở rộng HSC hoạt động, đã chỉnh sửa bằng CRISPR/Cas9 từ các quần thể tế bào tổng hợp cũng như từ các HSC đơn lẻ đã sao chép để tạo ra các cấy ghép có khả năng tái cấu trúc huyết học. Chúng tôi đã chỉ ra rằng các HSC từ mô hình murine PrkdcSCID, chứa một đột biến điểm trong gen Prkdc dẫn đến sự thiếu hụt tế bào B và T, có thể được chỉnh sửa và mở rộng để sửa chữa kiểu hình thiếu hụt miễn dịch sau khi cấy ghép. Hơn nữa, chúng tôi chứng minh rằng các HSC đơn, đã chỉnh sửa gen có thể được sao chép và mở rộng bằng cách sử dụng hệ thống của chúng tôi để tạo ra các HSC hoạt động cho SCT.
Phương pháp
Các HSC CD150+CD201+c-Kit+Lin- (CD150+CD201+KL) từ chuột C.B17/Icr-PrkdcSCID (SCID) đã được tách ra và nuôi cấy trong môi trường dựa trên polymer được bổ sung với các cytokine tái tổ hợp. Chỉnh sửa gene được thực hiện bằng cách sử dụng protein Cas9 và các gRNAs thích hợp được cung cấp dưới dạng phức hợp ribonucleoprotein (RNP) thông qua điện di. Các người cho HDR được cung cấp dưới dạng oligonucleotide đơn chuỗi (ssODNs). Các ca cấy ghép tế bào gốc (SCTs) đã được thực hiện sau bức xạ chết người với 2.5 Gy.
Kết quả
Để chứng minh rằng các HSC đã chỉnh sửa có thể được mở rộng như một quần thể tổng hợp và cấy ghép hiệu quả để sửa chữa kiểu hình bệnh, các HSC từ chuột SCID được dùng làm người cho đã bị chỉnh sửa gene tại locus Prkdc bằng phương pháp Cas9 (Hình 1a). Tổng số tế bào và các tế bào CD201+CD150+cKit+Lin- (KL) nguyên thủy đã mở rộng gấp 70 và 10 lần, tương ứng, trong vòng bảy ngày, sau đó các quần thể tổng hợp đã được cấy ghép vào chuột SCID. Phân tích phỏng đoán các chỉnh sửa CRISPR (ICE) được thực hiện tại thời điểm SCT chỉ ra tần suất HDR là 29%±10%. Sự xuất hiện của các tế bào B và T trong các mẫu máu ngoại vi đã được quan sát sau bốn tuần cấy ghép (B220+: 21±7%, CD4+: 27±4%, CD8+: 4±1%; Hình 1b). Chúng tôi cũng đã xác nhận sự hiện diện của các tế bào B và T trong lách và tuyến ức của chuột đã cấy ghép. Các thí nghiệm miễn dịch đã cho thấy các mức titer immunoglobulin tương đương với các chuột đối chứng khỏe mạnh sau khi bị thách thức với một kháng nguyên phụ thuộc T. Chúng tôi kết luận rằng việc mở rộng và SCT tự thân của các HSC đã chỉnh sửa khôi phục lại một vùng kem miễn dịch B và T chức năng ở chuột SCID. Tiếp theo, chúng tôi đặt câu hỏi liệu hệ thống của chúng tôi có thể được sử dụng để mở rộng các dòng HSC đơn, đã chỉnh sửa hay không. Để đạt được điều này, chúng tôi đã phân loại các dòng CD150+CD201+KL đã chỉnh sửa đơn lẻ bằng phương pháp phân tích dòng chảy và mở rộng chúng trong hai tuần. DNA gen đã được lấy mẫu từ các thuộc địa đang phát triển và kết quả chỉnh sửa tại locus Prkdc đã được đánh giá riêng lẻ nhằm sàng lọc các HSC đã được sửa chữa (Hình 2a). Sau khi cấy ghép các dòng được chọn, các tế bào B và T đã có thể được phát hiện bắt đầu từ 4 tuần và 8 tuần, tương ứng, trong máu ngoại vi (Hình 2b), cho thấy rằng các HSC chức năng có thể được mở rộng từ các dòng đã chỉnh sửa. Thú vị thay, chúng tôi nhận thấy rằng sự gần gũi có liên quan đến sự biểu hiện cao của EPCR trong các quần thể CD150+KL của các thuộc địa HSC có nguồn gốc từ tế bào đơn.
Kết luận
Chúng tôi đã chỉ ra rằng các HSC chức năng, đã chỉnh sửa bằng Cas9 từ chuột SCID và kiểu gen hoang dã có thể được mở rộng trong hệ thống nuôi cấy đã định nghĩa của chúng tôi. Các HSC SCID đã được sửa chữa đã góp phần vào sự tái cấu trúc huyết học của các dòng B và T tạo ra sự miễn dịch được khôi phục trong in vivo. Hơn nữa, chúng tôi đã có thể tạo ra các HSC có thể cấy ghép từ các dòng đã chỉnh sửa đơn lẻ. Cách tiếp cận này có ứng dụng quan trọng trong chỉnh sửa gene HSC và có tiềm năng vượt qua các chiến lược lựa chọn dựa trên marker vì các dòng riêng lẻ có thể được điều tra và chọn lựa cho các sự kiện chỉnh sửa gene có mục tiêu trước khi cấy ghép. Hệ thống mở rộng của chúng tôi sẽ phục vụ như một công cụ để thúc đẩy phát triển các chiến lược trị liệu gene có mục tiêu.
[1] Wilkinson et al., Nature 571, 117-121 (2019)
Công bố
Không có xung đột lợi ích nào liên quan để công bố.
