Nội dung được dịch bởi AI, chỉ mang tính chất tham khảo
Tạo ra thử nghiệm gen báo cáo NKX2.5 dựa trên tế bào gốc phôi người để thử nghiệm độc tính phát triển
Tóm tắt
Để kiểm tra một lượng lớn hóa chất về độc tính phát triển, cần các thử nghiệm in vitro nhanh với các chỉ số tiêu chuẩn hóa để thu thập dữ liệu tự động. Tuy nhiên, thử nghiệm được sử dụng rộng rãi nhất, thử nghiệm tế bào gốc phôi, dựa vào việc đếm các khối phôi đập bằng cách kiểm tra bằng mắt thường, điều này tốn công sức và thời gian. Chúng tôi đã phát triển thử nghiệm PluriBeat dựa trên sự phân hóa của các tế bào gốc vỏ não người (hiPSC), mà chúng tôi đã chứng minh là có thể dự đoán được các chất gây quái thai đã biết ở nồng độ liên quan bằng cách sử dụng chỉ số là các tế bào cơ tim đang đập. Ở đây, chúng tôi báo cáo sự phát triển của một thử nghiệm mới, mà chúng tôi gọi là thử nghiệm PluriLum, nơi chúng tôi đã giới thiệu một gen báo cáo luciferase vào vị trí NKX2.5 của dòng hiPSC của chúng tôi. Điều này cho phép chúng tôi đo cường độ phát quang thay vì đếm các tế bào cơ tim đang đập, điều này ít tốn công sức hơn. Chúng tôi đã thiết lập hai dòng tế bào báo cáo NKX2.5 và xác nhận tính đa năng và ổn định di truyền của chúng. Hơn nữa, chúng tôi xác nhận rằng dòng tế bào báo cáo NKX2.5 được kỹ thuật di truyền đã phân hóa thành các tế bào cơ tim với hiệu suất tương tự như dòng giống hoang dã ban đầu. Chúng tôi sau đó đã phơi nhiễm các tế bào với axit valproic (25–300 μM) và thalidomide (0.1–36 µM) và so sánh chỉ số PluriBeat của các tế bào cơ tim với cường độ phát quang của thử nghiệm PluriLum. Kết quả cho thấy rằng thalidomide làm giảm cường độ phát quang một cách đáng kể với sức mạnh và hiệu quả cao hơn so với chỉ số đập. Với điều này, chúng tôi đã phát triển một thử nghiệm mới dựa trên hiPSC với một chỉ số tiêu chuẩn hóa có thể có tiềm năng cho việc sàng lọc với thông lượng cao về độc tính phát triển.
Từ khóa
#độc tính phát triển #tế bào gốc phôi người #thử nghiệm PluriBeat #thử nghiệm PluriLum #NKX2.5 #luciferase #dị tật bẩm sinhTài liệu tham khảo
Aikawa N, Kunisato A, Nagao K et al (2014) Detection of thalidomide embryotoxicity by in vitro embryotoxicity testing based on human iPS cells. J Pharmacol Sci 124:201–207. https://doi.org/10.1254/jphs.13162FP
Brickman JM, Serup P (2016) Properties of embryoid bodies. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. https://doi.org/10.1002/wdev.259
Burridge PW, Thompson S, Millrod MA et al (2011) A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability. PLoS ONE. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0018293
Daston GP, Knudsen TB (2010) Fundamental concepts, current regulatory design and interpretation. Compr Toxicol Second Ed 12:3–9. https://doi.org/10.1016/B978-0-08-046884-6.01503-7
Elliott DA, Braam SR, Koutsis K et al (2011) NKX2-5(eGFP/w) hESCs for isolation of human cardiac progenitors and cardiomyocytes. Nat Methods 8:1037–1040. https://doi.org/10.1038/nmeth.1740
Fan F, Wood KV (2007) Bioluminescent assays for high-throughput screening. Assay Drug Dev Technol 5:127–136. https://doi.org/10.1089/adt.2006.053
Ho PI, Yue K, Pandey P et al (2013) Reporter enzyme inhibitor study to aid assembly of orthogonal reporter gene assays. ACS Chem Biol 8:1009–1017. https://doi.org/10.1021/cb3007264
Kameoka S, Babiarz J, Kolaja K, Chiao E (2014) A high-throughput screen for teratogens using human pluripotent stem cells. Toxicol Sci 137:76–90. https://doi.org/10.1093/toxsci/kft239
Kattman SJ, Witty AD, Gagliardi M et al (2011) Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines. Cell Stem Cell 8:228–240. https://doi.org/10.1016/j.stem.2010.12.008
Kim S, Kim D, Cho S et al (2014) Highly efficient RNA-guide genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Res 24:1012–1019. https://doi.org/10.1101/gr.171322.113
Kugler J, Tharmann J, De Sousa C, Lopes SM et al (2015) A Bmp reporter transgene mouse embryonic stem cell model as a tool to identify and characterize chemical teratogens. Toxicol Sci 146:374–385. https://doi.org/10.1093/toxsci/kfv103
Kugler J, Kemler R, Luch A, Oelgeschläger M (2016) Editor’s highlight: identification and characterization of teratogenic chemicals using embryonic stem cells isolated from a Wnt/β-catenin-reporter transgenic mouse line. Toxicol Sci 152:382–394. https://doi.org/10.1093/toxsci/kfw094
Lauschke K, Rosenmai AK, Meiser I et al (2020) A novel human pluripotent stem cell-based assay to predict developmental toxicity. Arch Toxicol. https://doi.org/10.1007/s00204-020-02856-6
Lints TJ, Parsons LM, Hartley L et al (1993) Nkx-2.5: a novel murine homeobox gene expressed in early heart progenitor cells and their myogenic descendants. Development 119:419–431
Lyons I, Parsons LM, Hartley L et al (1995) Myogenic and morphogenetic defects in the heart tubes of murine embryos lacking the homeo box gene Nkx2-5. Genes Dev 9:1654–1666. https://doi.org/10.1101/gad.9.13.1654
Mayshar Y, Yanuka O, Benvenisty N (2011) Teratogen screening using transcriptome profiling of differentiating human embryonic stem cells. J Cell Mol Med 15:1393–1401. https://doi.org/10.1111/j.1582-4934.2010.01105.x
Olson H, Betton G, Robinson D et al (2000) Concordance of the toxicity of pharmaceuticals in humans and in animals. Regul Toxicol Pharmacol 32:56–67. https://doi.org/10.1006/rtph.2000.1399
Palmer JA, Smith AM, Egnash LA et al (2013) Establishment and assessment of a new human embryonic stem cell-based biomarker assay for developmental toxicity screening. Birth Defects Res Part B Dev Reprod Toxicol 98:343–363. https://doi.org/10.1002/bdrb.21078
Rasmussen MA, Holst B, Tümer Z et al (2014) Transient p53 suppression increases reprogramming of human fibroblasts without affecting apoptosis and DNA damage. Stem Cell Rep 3:404–413. https://doi.org/10.1016/j.stemcr.2014.07.006
Schaafsma G, Kroese ED, Tielemans ELJP et al (2009) REACH, non-testing approaches and the urgent need for a change in mind set. Regul Toxicol Pharmacol 53:70–80. https://doi.org/10.1016/j.yrtph.2008.11.003
Schumacher HJ, Wilson JG, Terapane JF, Rosedale SL (1970) Thalidomide: disposition in rhesus monkey and studies of its hydrolysis in tissues of this and other species. J Pharmacol Exp Ther 173:265–269
Seiler A, Oelgeschläger M, Liebsch M et al (2011) Developmental toxicity testing in the 21st century: The sword of Damocles shattered by embryonic stem cell assays? Arch Toxicol 85:1361–1372. https://doi.org/10.1007/s00204-011-0767-1
Shinde V, Hoelting L, Srinivasan SP et al (2017) Definition of transcriptome-based indices for quantitative characterization of chemically disturbed stem cell development: introduction of the STOP-Tox ukn and STOP-Tox ukk tests. Arch Toxicol 91:839–864. https://doi.org/10.1007/s00204-016-1741-8
Spielmann H, Pohl I, Doering B, Liebsch M, Moldenhauer F (1997) The embryonic stem cell test, an in vitro embryotoxicity test using two permanent mouse cell lines: 3T3 fibroblasts and embryonic stem cells. In Vitro Toxicol 10:119–127
Thorne N, Shen M, Lea WA et al (2012) Firefly luciferase in chemical biology: a compendium of inhibitors, mechanistic evaluation of chemotypes, and suggested use as a reporter. Chem Biol 19:1060–1072. https://doi.org/10.1016/j.chembiol.2012.07.015
Tomson T, Battino D, Bonizzoni E et al (2011) Dose-dependent risk of malformations with antiepileptic drugs: An analysis of data from the EURAP epilepsy and pregnancy registry. Lancet Neurol 10:609–617. https://doi.org/10.1016/S1474-4422(11)70107-7
Uibel F, Mühleisen A, Köhle C et al (2010) ReProGlo: a new stem cell-based reporter assay aimed to predict embryotoxic potential of drugs and chemicals. Reprod Toxicol 30:103–112. https://doi.org/10.1016/j.reprotox.2009.12.002
Vargesson N (2015) Thalidomide-induced teratogenesis: history and mechanisms. Birth Defects Res Part C Embryo Today Rev 105:140–156. https://doi.org/10.1002/bdrc.21096
Walker JR, Hall MP, Zimprich CA et al (2017) Highly potent cell-permeable and impermeable NanoLuc luciferase inhibitors. ACS Chem Biol 12:1028–1037. https://doi.org/10.1021/acschembio.6b01129
Worley KE, Rico-Varela J, Ho D, Wan LQ (2018) Teratogen screening with human pluripotent stem cells. Integr Biol (United Kingdom) 10:491–501. https://doi.org/10.1039/c8ib00082d
Zink D, Kai J, Chuah C, Ying JY (2020) Assessing toxicity with human cell-based in vitro methods. Trends Mol Med. https://doi.org/10.1016/j.molmed.2020.01.008