Tạo và phát hiện các trình tự 16S rRNA chimeric trong các sản phẩm PCR được giải trình tự Sanger và 454-pyrosequenced
Tóm tắt
Đa dạng vi khuẩn trong các mẫu môi trường thường được đánh giá bằng cách sử dụng các trình tự gen 16S rRNA (16S) khuếch đại bằng PCR. Tuy nhiên, sự đa dạng được cảm nhận có thể bị ảnh hưởng bởi việc chuẩn bị mẫu, việc lựa chọn mồi và hình thành các sản phẩm khuếch đại 16S chimeric. Chimera là các sản phẩm lai tạo giữa nhiều trình tự gốc có thể bị diễn giải sai là các sinh vật mới, do đó làm gia tăng sự đa dạng rõ ràng. Chúng tôi đã phát triển một công cụ phát hiện chimera mới gọi là Chimera Slayer (CS). CS phát hiện các chimera với độ nhạy lớn hơn so với các phương pháp trước đây, hoạt động tốt trên các trình tự ngắn như những trình tự được tạo ra bởi máy giải trình tự Genome của 454 Life Sciences (Roche), và có thể mở rộng đến các bộ dữ liệu lớn. Bằng cách so sánh hiệu suất CS với các trình tự từ một hỗn hợp DNA kiểm soát của các sinh vật đã biết và một tập hợp chimera được mô phỏng, chúng tôi cung cấp những hiểu biết về các yếu tố ảnh hưởng đến sự hình thành chimera như sự phong phú của trình tự, mức độ tương đồng giữa các gen 16S và điều kiện PCR. Các chimera được phát hiện có xu hướng hình thành lại giữa các lần khuếch đại độc lập và góp phần vào những nhận thức sai lệch về sự đa dạng của mẫu cũng như việc nhận dạng sai các loại mới, với các loài ít phong phú cho thấy tỷ lệ chimera vượt quá 70%. Các trình tự metagenomic không mục tiêu của cộng đồng mô phỏng của chúng tôi dường như không có chimera 16S, hỗ trợ một vai trò của metagenomics trong việc xác nhận các sinh vật mới được phát hiện trong các khảo sát trình tự mục tiêu.
Từ khóa
#chimera #16S rRNA #đa dạng vi khuẩn #phát hiện chimera #Chimera Slayer #metagenomic #khuếch đại PCR #trình tự gen #phân tử học #sinh vật mớiTài liệu tham khảo
2010, Ironing out the wrinkles in the rare biosphere through improved OTU clustering, Environ Microbiol, 12, 1889, 10.1111/j.1462-2920.2010.02193.x
1997, A new computational method for detection of chimeric 16S rRNA artifacts generated by PCR amplification from mixed bacterial populations, Appl Environ Microbiol, 63, 2338, 10.1128/aem.63.6.2338-2346.1997
2010, Wrinkles in the rare biosphere: Pyrosequencing errors can lead to artificial inflation of diversity estimates, Environ Microbiol, 12, 118, 10.1111/j.1462-2920.2009.02051.x
2009, Reducing the impact of PCR-mediated recombination in molecular evolution and environmental studies using a new-generation high-fidelity DNA polymerase, Biotechniques, 47, 857, 10.2144/000113219
Lane D . 1991. 16S/23S rRNA sequencing. John Wiley & Sons Ltd., Chichester, United Kingdom.
1997, Frequency of formation of chimeric molecules as a consequence of PCR coamplification of 16S rRNA genes from mixed bacterial genomes, Appl Environ Microbiol, 63, 4645, 10.1128/aem.63.12.4645-4650.1997