Những thách thức và tiêu chuẩn hóa việc phân tích microRNA trong huyết thanh và dịch não tủy ở chó mắc bệnh viêm não không lây nhiễm
Tóm tắt
Các tình trạng bệnh lý viêm não không lây nhiễm (NII) chủ yếu được chẩn đoán qua việc phát hiện các thay đổi viêm trong dịch não tủy (CSF). Tuy nhiên, cần có các phương pháp ít xâm lấn hơn và các chỉ số sinh học ngoại biên. Sự thay đổi của các microRNA lưu hành (miRNA), là các RNA điều hòa ngắn không mã hoá có thể đóng vai trò như các chỉ số bệnh lý. Mục tiêu của nghiên cứu thí điểm này là điều tra các miRNA đã chọn trong huyết thanh và CSF, với giả thuyết rằng nồng độ của các miRNA cụ thể trong huyết thanh tương quan với sự hiện diện của chúng trong CSF, và rằng sự thay đổi nồng độ miRNA trong huyết thanh có thể phản ánh bệnh lý ở hệ thần kinh trung ương (CNS). Chúng tôi đã phân tích mẫu huyết thanh và CSF bằng phương pháp PCR thời gian thực định lượng (qPCR) tìm kiếm các miRNA đã chọn và được phân tích trước đó trong huyết thanh (let-7a, let-7c, miR-15b, miR-16, miR-21, miR-23a, miR-24, miR-26a, miR-146a, miR-155, miR-181c và miR-221-3p) và trong CSF (let-7c, miR-16, miR-21, miR-24, miR-146a, miR-155, miR-181c và miR-221-3p) từ 13 con chó mắc bệnh NII ở CNS và sáu con chó đối chứng. Chúng tôi đã chứng minh sự hiện diện của một số miRNA trong CSF (let-7c và miR-21 là chủ yếu) và huyết thanh (miR-23a và miR-21 là chủ yếu). Tuy nhiên, chúng tôi đã không tái tạo được kết quả nhất quán trong các mẫu CSF do một số lý do: hiệu suất PCR không thể chấp nhận, sự biến động lớn giữa các bản sao cDNA và/hoặc không khuếch đại trong qPCR cho thấy nồng độ rất thấp của các miRNA được nghiên cứu trong CSF của chó. Các mẫu huyết thanh cho kết quả tốt hơn, và 10 bài kiểm tra qPCR của miRNA đã được đủ điều kiện cho phân tích. Dù vậy, chúng tôi vẫn không thể phát hiện sự khác biệt trong mức độ biểu hiện của các miRNA giữa các trường hợp và đối chứng. Hơn nữa, chúng tôi không thể xác nhận các kết quả từ các nghiên cứu gần đây về miRNA của các bệnh lý CNS ở chó. Chúng tôi tin rằng những bất đồng này nêu bật tác động đáng kể của sự biến thiên phương pháp/analytical, chứ không phải là sức mạnh kém của các miRNA lưu hành như là chỉ số của bệnh lý CNS. Một mục tiêu thứ cấp vì thế là truyền đạt những thách thức phương pháp trong nghiên cứu của chúng tôi và đề xuất các khuyến nghị cho việc phân tích miRNA lưu hành, bao gồm các phương pháp trước, sau và phân tích dựa trên kinh nghiệm của chúng tôi, để đạt được những kết quả có thể tái sản xuất và so sánh trong nghiên cứu miRNA thú y.
Từ khóa
Tài liệu tham khảo
Cortez MA, Bueso-Ramos C, Ferdin J, Lopez-Berestein G, Sood AK, Calin GA. MicroRNAs in body fluids—the mix of hormones and biomarkers. Nat Rev Clin Oncol. 2011. https://doi.org/10.1038/nrclinonc.2011.76.
Alexandrov PN, Dua P, Hill JM, Bhattacharjee S, Zhao Y, Lukiw WJ. microRNA (miRNA) speciation in Alzheimer’s disease (AD) cerebrospinal fluid (CSF) and extracellular fluid (ECF). Int J Biochem Mol Biol. 2012;3:365–73.
Sørensen SS, Nygaard AB, Nielsen MY, Jensen K, Christensen T. miRNA expression profiles in cerebrospinal fluid and blood of patients with acute ischemic stroke. Transl Stroke Res. 2014;5:711–8.
Sørensen SS, Nygaard AB, Carlsen AL, Heegaard NHH, Bak M, Christensen T. Elevation of brain-enriched miRNAs in cerebrospinal fluid of patients with acute ischemic stroke. Biomark Res. 2017. https://doi.org/10.1186/s40364-017-0104-9.
Drusco A, Bottoni A, Laganà A, Acunzo M, Fassan M, Cascione L, et al. A differentially expressed set of microRNAs in cerebro-spinal fluid (CSF) can diagnose CNS malignancies. Oncotarget. 2015;6:20829–39.
Gaitero L, Russell SJ, Monteith G, LaMarre J. Expression of microRNAs miR-21 and miR-181c in cerebrospinal fluid and serum in canine meningoencephalomyelitis of unknown origin. Vet J. 2016;216:122–4.
Marioni-Henry K, Zaho D, Amengual-Batle P, Rzechorzek NM, Clinton M. Expression of microRNAs in cerebrospinal fluid of dogs with central nervous system disease. Acta Vet Scand. 2018;60:80.
Vansteenkiste DP, Fenger JM, Fadda P, Martin-Vaquero P, da Costa RC. MicroRNA expression in the cerebrospinal fluid of dogs with and without cervical spondylomyelopathy. J Vet Intern Med. 2019. https://doi.org/10.1111/jvim.15636.
Enelund L, Nielsen LN, Cirera S. Evaluation of microRNA stability in plasma and serum from healthy dogs. Microrna. 2017;6:42–52.
Andreasen D, Fog JU, Biggs W, Salomon J, Dahslveen IK, Baker A, et al. Improved microRNA quantification in total RNA from clinical samples. Methods. 2010;50:S6–9.
Balcells I, Cirera S, Busk PK. Specific and sensitive quantitative RT-PCR of miRNAs with DNA primers. BMC Biotechnol. 2011;11:70.
Busk PK. A tool for design of primers for microRNA-specific quantitative RT-qPCR. BMC Bioinf. 2014;15:1–9.
Vandesompele J, De Preter K, Pattyn F, Poppe B, Van Roy N, De Paepe A, et al. Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes. Genome Biol. 2002;3:4–11.
Andersen CL, Jensen JL, Orntoft TF. Normalization of real-time quantitative reverse transcription-PCR data: a model-based variance estimation approach to identify genes suited for normalization, applied to bladder and colon cancer data sets. Cancer Res. 2004;64:5245–50.
Reid G, Kirschner MB, van Zandwijk N. Circulating microRNAs: association with disease and potential use as biomarkers. Crit Rev Oncol Hematol. 2011. https://doi.org/10.1016/j.critrevonc.2010.11.004.
de Ronde MWJ, Ruijter JM, Moerland PD, Creemers EE, Pinto-Sietsma SJ. Study design and qPCR data analysis guidelines for reliable circulating miRNA biomarker experiments: a review. Clin Chem. 2018;64:1308–18.
López AG, Brogaard L, Heegaard PMH, Cirera S, Skovgaard K. AU Content in the MicroRNA sequence influences its stability after heat treatment. Microrna. 2019. https://doi.org/10.2174/2211536608666190131102252.
Blondal T, Nielsen SJ, Baker A, Andreasen D, Mouritzen P, Teilum MW, et al. Assessing sample and miRNA profile quality in serum and plasma or other biofluids. Methods. 2013;59:S1–6.
Jessen LR, Nielsen LN, Kieler IN, Langhorn R, Reezigt BJ, Cirera S. Stability and profiling of urinary microRNAs in healthy cats, cats with pyelonephritis, and cats with other urological conditions. J Vet Intern Med. 2019. https://doi.org/10.1111/jvim.15628.