Nội dung được dịch bởi AI, chỉ mang tính chất tham khảo
Sự can thiệp có hướng của CRISPR-Cas9 vào gen FAD2–2 trong cây đậu nành (Glycine max.L)
Tóm tắt
Cải tiến gần đây trong lĩnh vực kỹ thuật gen đã bao gồm nhiều cấp độ kỹ thuật gen thực vật, thu hút sự phấn khích lớn từ các nhà sinh học thực vật trên toàn thế giới. Hệ thống CRISPR Cas9 có hướng dẫn bằng RNA đã xuất hiện như một công cụ hứa hẹn trong đột biến có định hướng do việc sử dụng sáng tạo của nó trong các nhánh khác nhau của sinh học. Hệ thống nuclease CRISPR-Cas9 đã vượt qua tất cả các chiến lược trước đó và những cạm bẫy liên quan đến đột biến đặc hiệu vị trí. Ở đây, chúng tôi đã thực hiện một sự tích hợp/đột biến đặc hiệu theo trình tự hiệu quả của gen FAD2–2 trong cây đậu nành sử dụng hệ thống nuclease CRISPR-Cas9. Một trình tự RNA hướng dẫn đơn lẻ đã được thiết kế với sự trợ giúp của một số công cụ sinh tin học nhằm nhắm đến các vị trí khác nhau trên loci FAD2–2 trong cây đậu nành. Vectơ nhị phân (pCas9-AtU6-sgRNA) đã được chuyển giao thành công vào lá mầm của đậu nành bằng cách sử dụng Agrobacterium tumafacien. Tổng hợp các phát hiện của chúng tôi cho thấy rằng các đột biến transgenic của cây đậu nành được áp dụng cho đột biến có định hướng đã được phát hiện một cách đáng ngạc nhiên trong gen mục tiêu của chúng tôi. Hơn nữa, việc phát hiện gen Cas9, gen BAR, và trình tự NOS đã được thực hiện tương ứng. Phân tích Southern blot xác nhận sự chuyển gen Cas9 vào cây đậu nành một cách ổn định. Biểu hiện thời gian thực với qRT-PCR và phân tích giải trình tự Sanger xác nhận sự đột biến hiệu quả do CRISPR-Cas9/sgRNA gây ra trong trình tự mục tiêu của loci FAD2–2. Sự tích hợp của vùng mục tiêu FAD2–2 dưới dạng thay thế, xóa bỏ và chèn đã đạt được với tần suất cao đáng kể và đột biến không mục tiêu hiếm. Tỷ lệ đột biến cao đã được ghi nhận là 21% trong số tất cả các cây đậu nành transgenic được áp dụng cho đột biến có định hướng. Hơn nữa, quang phổ hồng ngoại gần (NIR) cho thấy toàn bộ hồ sơ axit béo thu được từ hạt giống của các đột biến. Một sự điều chỉnh đáng kể về hàm lượng axit oleic lên tới (65,58%) trong khi mức thấp nhất của axit linoleic là (16,08%) đã được ghi nhận. Dựa trên những phát hiện này, hệ thống CRISPR-Cas9 có thể tóm tắt sự phát triển gần đây và những thách thức trong tương lai trong việc phát triển các giống cây trồng quan trọng về nông nghiệp.
Từ khóa
#CRISPR-Cas9 #FAD2–2 #đậu nành #đột biến có định hướng #axit béo #chuyển genTài liệu tham khảo
Smith NA, Singh SP, Wang MB, Stoutjesdijk PA, Green AG, Waterhouse PM. Total silencing by intron-spliced hairpin RNAs. Nature. 2000;407:319–20.
Girija M, Dhanavel D, Gnanamurthy S. Gamma Rays and EMS Induced Flower Color and Seed Mutants in Cowpea (Vignaunguiculata L. Walp). Advances in Applied Science Research. 2013;4:134–9.
Sun X, et al. Targeted mutagenesis in soybean using the CRISPR-Cas9 system. Sci. Rep. 2015;5:10,342. https://doi.org/10.1038/srep10342.
Feng Z, Mao Y, Xu N, Zhang B, Wei P, Yang DL, Wang Z, Zhang Z, Zheng R, Yang L, et al. Multigeneration analysis reveals the inheritance, specificity, and patterns of CRISPR/Cas-induced gene modifications in Arabidopsis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2014;111:4632–7.
Zhang H, Zhang J, Wei P, Zhang B, Gou F, Feng Z, Mao Y, Yang L, Zhang H, Xu N, et al. The CRISPR/Cas9 system produces specific and homozygous targeted gene editing in rice in one generation. Plant Biotechnol J. 2014;12:797–807.
Li Z, Zhan-B L, Aiqiu X, Bryan PM, Jessica PK, Lingxia HR, Ward T, Clifton E, Carl Falco S, Mark Cigan A. Cas9-Guide RNA Directed Genome Editing in Soybean. Plant Physiology. 2015;169:960–70.
Rinaldo AR, Ayliffe M. Gene targeting and editing in crop plants: a new era of precision opportunities. Mol Breed. 2015;35:40.
Zhou H, Liu B, Weeks DP, Spalding MH, Yang B. Large chromosomal deletions and heritable small genetic changes induced by CRISPR/Cas9 in rice. Nucleic Acids Res. 2014;42:10903–14.
Wang F, Wang C, Liu P, Lei C, Hao W, Gao Y, Liu Y-G, Zhao K. Enhanced rice blast resistance by CRISPR/Cas9-targeted mutagenesis of the ERF transcription factor gene. OsERF922. PLoS One. 2016;11:e0154027.
Soybean Oil and Biodiesel Usage Projections & Balance Sheet [http://www.extension. iastate.edu/agdm/crops/outlook/biodieselbalancesheet.pdf]
Bhardwaj S, Passi SJ, Misra A. Overview of trans fatty acids: biochemistry and health effects. Diabetes Metab Syndr. 2011;5(3):161–4.
Sales-Campos H, de Souza PR, Peghini BC, da Silva JS, Cardoso CR. An overview of the modulatory effects of oleic acid in health and disease. Mini-Rev Med Chem. 2013;13(2):201–10.
Raneses AR, Glaser LK, Price JM, Duffield JA. Potential biodiesel markets and their economic effects on the agricultural sector of the United States. Ind Crop Prod. 1999;9(2):151–62.
Okuley J, Lightner J, Feldmann K, Yadav N, Lark E, Browse J. Arabidopsis FAD2 gene encodes the enzyme that is essential for polyunsaturated lipid synthesis. Plant Cell. 1994;6(1):147–58.
Spychalla JP, Kinney AJ, Browse J. Identification of an animal ω-8 fatty acid desaturase by heterologous expression in Arabidopsis. Proc Natl Acad Sci U S A. 1997;94(4):1142–7.
Cao S, Zhou X, Wood CC, et al. A large and functionally diverse family of Fad2 genes in safflower (Carthamustinctorius L.). BMC Plant Biol. 2013;13(1):5.
Lam H-M, Xu X, Liu X, Chen WB, Yang GH, Wong FL, Li MW, He WM, Qin N, Wang B, Li J, Jian M, Wang JA, Shao G, Wang J, Sun SSM, Zhang GY. Resequencing of 31 wild and cultivated soybean genomes identifies patterns of genetic diversity and selection. Nat. Genet. 2010;42:1053e1059.
Jackson SA, Iwata A, Lee SH, Schmutz J, Shoemaker R. Sequencing crop genomes: approaches and applications. New Phytol. 2011;191:915e925.
Belhaj K, Chaparro-Garcia A, Kamoun S, Nekrasov V. Plant genome editing made easy: targeted mutagenesis in model and crop plants using the CRISPR/Cas system. Plant Methods. 2013;9:39.
Hsu PD, et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nat Biotechnol. 2013;31:827–32.
Chen X, et al. Targeted mutagenesis in cotton (GossypiumhirsutumL.) using the CRISPR/Cas9 system. Sci. Rep. 2017;7:44304. https://doi.org/10.1038/srep44304.
Jinek M, Chylinski K, Fonfara I, Hauer M, Doudna JA, Charpentier E. A programmable dual-RNA–guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 2012;1:225,829.
Jiang W, Zhou H, Bi H, Fromm M, Yang B, Weeks DP. Demonstration of CRISPR/Cas9/sgRNA-mediated targeted gene modification in Arabidopsis, tobacco, sorghum and rice. Nucleic Acids Res. 2013;41(20):e188 gkt780.
Li J-F, Norville JE, Aach J, McCormack M, Zhang D, Bush J, Church GM, Sheen J. Multiplex and homologous recombination–mediated genome editing in Arabidopsis and Nicotiana benthamiana using guide RNA and Cas9. Nature Biotechnol. 2013;31(8):688.
Ma X, Zhang Q, Zhu Q, Liu W, Chen Y, Qiu R, Wang B, Yang Z, Li H, Lin Y. A robust CRISPR/Cas9 system for convenient, high-efficiency multiplex genome editing in monocot and dicot plants. Mol Plant. 2015;8(8):1274–84.
Svitashev S, Young J, Schwartz C, Gao H, Falco SC, Cigan AM. Targeted mutagenesis, precise gene editing and site-specific gene insertion in maize using Cas9 and guide RNA. Plant Physiol. 2015;169:00793.2015.
Buchanan BB, Gruissem W, Jones RL. Biochemistry & molecular biology of plants, vol. 40. Rockville: American Society of Plant Physiologists; 2000.
Beisson F, Koo AJ, Ruuska S, Schwender J, Pollard M, Thelen JJ, Paddock T, Salas JJ, Savage L, Milcamps A. Arabidopsis genes involved in acyl lipid metabolism. A 2003 census of the candidates, a study of the distribution of expressed sequence tags in organs, and a web-based database. Plant Physiol. 2003;132(2):681–97.
Jin U-H, Lee J-W, Chung Y-S, Lee J-H, Yi Y-B, Kim Y-K, Hyung N-I, Pyee J-H, Chung C-H. Characterization and temporal expression of a ω-6 fatty acid desaturase cDNA from sesame (Sesamum indicum L.) seeds. Plant Sci. 2001;161(5):935–41.
Kinney AJ, Cahoon EB, Hitz WD. Manupulating desaturase activities in transgenic crop plants: Biochemical Society Transactions. 2002;30(6):1099–103.
Hernández ML, Mancha M, Martínez-Rivas JM. Molecular cloning and characterization of genes encoding two microsomal oleate desaturases (FAD2) from olive. Phytochemistry. 2005;66(12):1417–26.
Li L, Wang X, Gai J, Yu D. Molecular cloning and characterization of a novel microsomal oleate desaturase gene from soybean. J Plant Physiol. 2007;164(11):1516–26.
Rolletschek H, Borisjuk L, Sánchez-García A, Gotor C, Romero LC, Martínez-Rivas JM, Mancha M. Temperature-dependent endogenous oxygen concentration regulates microsomal oleate desaturase in developing sunflower seeds. J Exper Botany. 2007;58(12):3171–81.
Pirtle IL, Kongcharoensuntorn W, Nampaisansuk M, Knesek JE, Chapman KD, Pirtle RM. Molecular cloning and functional expression of the gene for a cotton Δ-12 fatty acid desaturase (FAD2). Biochim Biophys Acta (BBA)-Gene Structure and Expression. 2001;1522(2):122–9.
Wang Y, Zhang X, Zhao Y, Prakash C, He G, Yin D. Insights into the novel members of the FAD2 gene family involved in high-oleate fluxes in peanut. Genome. 2015;58(8):375–83.
Suresha G, Santha I. Molecular cloning and in silico analysis of novel oleate desaturase gene homologues from Brassica juncea through sub-genomic library approach. Plant Omics. 2013;6(1):55.
Zhang L, Yang XD, Zhang YY, Yang J, Qi GX, Guo DQ, Xing GJ, Yao Y, Xu WJ, Li HY. Changes in oleic acid content of transgenic soybeans by antisense RNA mediated posttranscriptional gene silencing. Int J Genom. 2014;2014:921950.
Palomer X, Pizarro-Delgado J, Barroso E, Vázquez-Carrera M. Palmitic and Oleic Acid: The Yin and Yang of Fatty Acids in Type 2 Diabetes Mellitus. Trends in Endocrinology & Metabolism. 2017;29(Issue 3):135–200.
Zhang F, Xiang-dong Y, Yuan-yu Z, Jing Y, Guang-xun Q, Dong-quan G, Guo-jie X, Yao Y, Wen JX, Hai YL, QY L, Ying SD. Changes in Oleic Acid Content of Transgenic Soybeans by Antisense RNA Mediated Posttranscriptional Gene Silencing. Int J Genomics. 2014;2014:921950.
Cantu D, et al. Comparative analysis of protein-protein interactions in the defense response of rice and wheat. BMC Genomics. 2013;14:166.
Paz MM, Martinez JC, Kalvig AB, Fonger TM, Wang K. Improved cotyledonary node method using an alternative explant derived from mature seed for efficient Agrobacterium-mediated soybean transformation. Plant Cell Rep. 2006;25:206–13.
Wang G-F, Li W-Q, Li W-Y, Wu G-L, Zhou C-Y, Chen K-M. Characterization of rice NADPH oxidase genes and their expression under various environmental conditions. Int J Mol Sci. 2013;14:9440–58.
Kovalenko IV. “Determination of amino and fatty acid composition of soybeans using near-infrared spectroscopy”. Retrospective Theses and Dissertations; 2005. p. 1245.