Nội dung được dịch bởi AI, chỉ mang tính chất tham khảo
Một thử nghiệm giao tiếp liên bào qua khe hở mới tương thích với sàng lọc cao
Tóm tắt
Các khe hở giao tiếp (GJs) là các kênh liên bào cho phép phân tử nhỏ hơn 1 kDa có thể khuếch tán và được đề xuất là mục tiêu của thuốc. Để phát triển các loại thuốc hóa học tác động vào mục tiêu này, một hệ thống sàng lọc cao (HTS) cho các chất điều biến GJ là cần thiết. Chúng tôi đã thiết kế một thử nghiệm giao tiếp liên bào qua khe hở GJ mới với khả năng sàng lọc cao. Hệ thống thử nghiệm này bao gồm các tế bào cho và tế bào nhận từ tế bào u tế bào thần kinh LN215, trong đó tế bào cho biểu hiện SLC26A4 và protein huỳnh quang vàng-H148Q/I152L (YFPQL). Độ phát quang của tế bào nhận LN215-YFPQL, khi nuôi cấy độc lập, không bị tắt bởi iod. Tuy nhiên, khi các tế bào cho và nhận, hay tế bào LN215-YFPQL và tế bào LN215-I−, được trộn lẫn và đặt thành đĩa, chúng đã hình thành các GJ. Khi iod được thêm vào, nó được vận chuyển vào tế bào cho qua SLC26A4, khuếch tán qua các GJ đến tế bào nhận và tắt độ phát quang YFPQL. Tỷ lệ tắt đạt tối ưu ở tỷ lệ 2:1 giữa tế bào cho và tế bào nhận. Tham số chất lượng thử nghiệm, yếu tố Z’, được tính toán từ dữ liệu thu thập từ thuốc thử và carbenoxolone. Đối với mỗi thử nghiệm, yếu tố Z’ tăng theo thời gian. Yếu tố Z’ của thử nghiệm 10 giây là 0,72 cho thấy rằng chất lượng thử nghiệm đủ cao để sử dụng trong HTS. Hệ thống thử nghiệm này cũng hoạt động tốt trong các tế bào u xương HOS với yếu tố Z’ tại 10 giây là 0,70. Chúng tôi đã phát triển một hệ thống HTS mới cho các chất điều biến GJ. Hệ thống có chất lượng thử nghiệm cao với yếu tố Z’ ≥ 0,70, nhanh chóng chỉ yêu cầu 10 giây mỗi giếng, chi phí thấp mà không cần thuốc thử bổ sung, và được dự đoán có tỷ lệ dương tính giả thấp.
Từ khóa
#giao tiếp liên bào #khe hở giao tiếp #sàng lọc cao #SLC26A4 #protein huỳnh quang #H148Q/I152L #thử nghiệm chất lượng #carbenoxoloneTài liệu tham khảo
Alexander DB, Goldberg GS. Transfer of biologically important molecules between cells through gap junction channels. Curr Med Chem. 2003;10(19):2045–58.
Willecke K, Eiberger J, Degen J, Eckardt D, Romualdi A, Guldenagel M, et al. Structural and functional diversity of connexin genes in the mouse and human genome. Biol Chem. 2002;383(5):725–37.
Gerido DA, White TW. Connexin disorders of the ear, skin, and lens. Biochim Biophys Acta. 2004;1662(1–2):159–70.
Laird DW. Syndromic and non-syndromic disease-linked Cx43 mutations. FEBS Lett. 2014;588(8):1339–48.
De Vuyst E, Boengler K, Antoons G, Sipido KR, Schulz R, Leybaert L. Pharmacological modulation of connexin-formed channels in cardiac pathophysiology. Br J Pharmacol. 2011;163(3):469–83.
Patel SJ, Milwid JM, King KR, Bohr S, Iracheta-Velle A, Li M, et al. Gap junction inhibition prevents drug-induced liver toxicity and fulminant hepatic failure. Nat Biotechnol. 2012;30(2):179–83.
Hawat G, Benderdour M, Rousseau G, Baroudi G. Connexin 43 mimetic peptide Gap26 confers protection to intact heart against myocardial ischemia injury. Arch Eur J Physiol. 2010;460(3):583–92.
Plotkin LI, Lezcano V, Thostenson J, Weinstein RS, Manolagas SC, Bellido T. Connexin 43 is required for the anti-apoptotic effect of bisphosphonates on osteocytes and osteoblasts in vivo. J Bone Mineral Res. 2008;23(11):1712–21.
Abbaci M, Barberi-Heyob M, Blondel W, Guillemin F, Didelon J. Advantages and limitations of commonly used methods to assay the molecular permeability of gap junctional intercellular communication. BioTech. 2008;45(1):33–52. 56–62.
Kanno Y, Loewenstein WR. Intercellular diffusion. Science. 1964;143(3609):959–60.
El Fouly MH, Trosko JE, Chang CC. Scrape-loading and dye transfer. A rapid and simple technique to study gap junctional intercellular communication. Exp Cell Res. 1987;168(2):422–30.
Raptis LH, Brownell HL, Firth KL, Mackenzie LW. A novel technique for the study of intercellular, junctional communication: electroporation of adherent cells on a partly conductive slide. DNA Cell Biol. 1994;13(9):963–75.
Wade MH, Trosko JE, Schindler M. A fluorescence photobleaching assay of gap junction-mediated communication between human cells. Science. 1986;232(4749):525–8.
Galietta LJ, Haggie PM, Verkman AS. Green fluorescent protein-based halide indicators with improved chloride and iodide affinities. FEBS Lett. 2001;499(3):220–4.
Tani E, Nishiura M, Higashi N. Freeze-fracture studies of gap junctions of normal and neoplastic astrocytes. Acta Neuropathol. 1973;26(2):127–38.
Davidson JS, Baumgarten IM, Harley EH. Reversible inhibition of intercellular junctional communication by glycyrrhetinic acid. Biochemical and biophysical research communications. 1986;134(1):29–36.
Zhang JH, Chung TD, Oldenburg KR. A simple statistical parameter for Use in evaluation and validation of high throughput screening assays. J Biomol Screen. 1999;4(2):67–73.
Li Z, Yan Y, Powers EA, Ying X, Janjua K, Garyantes T, et al. Identification of gap junction blockers using automated fluorescence microscopy imaging. J Biomol Screen. 2003;8(5):489–99.
Homolya L, Hollo Z, Germann UA, Pastan I, Gottesman MM, Sarkadi B. Fluorescent cellular indicators are extruded by the multidrug resistance protein. J Biol Chem. 1993;268(29):21493–6.
Haq N, Grose D, Ward E, Chiu O, Tigue N, Dowell SJ, et al. A high-throughput assay for connexin 43 (Cx43, GJA1) gap junctions using codon-optimized aequorin. Assay Drug Dev Technol. 2013;11(2):93–100.
Penuela S, Gehi R, Laird DW. The biochemistry and function of pannexin channels. Biochim Biophys Acta. 2013;1828(1):15–22.
Sahu G, Sukumaran S, Bera AK. Pannexins form gap junctions with electrophysiological and pharmacological properties distinct from connexins. Sci Reports. 2014;4:4955.
Luo J, Kaplitt MG, Fitzsimons HL, Zuzga DS, Liu Y, Oshinsky ML, et al. Subthalamic GAD gene therapy in a Parkinson’s disease rat model. Science. 2002;298(5592):425–9.
Olbina G, Eckhart W. Mutations in the second extracellular region of connexin 43 prevent localization to the plasma membrane, but do not affect its ability to suppress cell growth. Mol Cancer Res. 2003;1(9):690–700.