Một phương pháp đánh giá mạnh mẽ để sàng lọc các ứng viên thuốc cho bệnh thiếu máu Diamond-Blackfan

Bệnh thiếu máu Diamond-Blackfan (DBA) là một hội chứng suy tủy xương liên quan đến sự thiếu hụt protein ribosome (RP) do các đột biến trong các gen RP. 25% bệnh nhân mang các đột biến trong gen RPS19. Một đặc điểm nổi bật của DBA là sự ngừng phát triển của các tế bào tiền thân hồng cầu. Vẫn chưa rõ làm thế nào sự thiếu hụt của các RP, vốn thiết yếu cho tất cả các loại tế bào, lại ảnh hưởng đến phân khúc hồng cầu nghiêm trọng hơn các phân khúc khác. Hiện nay, bệnh nhân DBA được điều trị bằng glucocorticoid và/hoặc truyền máu, thường trong thời gian dài, gây ra nhiều tác dụng phụ nghiêm trọng. Chúng tôi giả thuyết rằng các loại thuốc mới với cơ chế điều trị đặc hiệu hơn có thể được phát triển và những loại thuốc đó sẽ vượt trội hơn so với các phương pháp điều trị hiện tại. Để đạt được mục tiêu này, chúng tôi đã phát triển một phương pháp để sàng lọc các thư viện hóa học nhằm xác định các ứng viên thuốc mới. Việc sử dụng tế bào từ bệnh nhân DBA là không khả thi do sự hạn chế về số lượng, điều này nghiêm trọng hạn chế quy mô của thư viện sàng lọc. Các dòng tế bào bất tử cũng không thích hợp vì cơ chế bệnh tật liên quan đến sự kích hoạt TP53 và hầu hết các dòng tế bào có sự rối loạn trong con đường TP53. Do đó, chúng tôi đã sử dụng các tế bào tiền thân hồng cầu c-Kit+ E14.5-15.5 từ gan thai nhi của mô hình chuột DBA với sự biểu hiện hiệu ứng rps19-shRNA có thể kích hoạt bằng doxycycline. Đặc điểm sinh học của DBA được kích thích bằng cách thêm doxycycline vào môi trường nuôi cấy, qua đó làm giảm sự phát triển của hồng cầu trên 80%. Việc giải cứu cho sự thiếu sót trong sự phát triển này là một đọc biểu hiện đơn giản và liên quan cho việc sàng lọc quy mô lớn. Việc phát triển thử nghiệm trong các đĩa vi mô 96 giếng cho phép xử lý chất lỏng một cách hợp lý. Đầu tiên, phương pháp đọc sự phát triển đã được tối ưu hóa. Việc sử dụng CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay tạo ra dữ liệu với mối tương quan tuyến tính tốt hơn với số lượng tế bào so với các phương pháp Prestobluë và siêu vi hình học nội dung cao. Để cho phép sàng lọc quy mô lớn, thử nghiệm đã được tối ưu hóa hơn nữa cho số lượng tế bào mỗi giếng, thành phần môi trường, thời gian nuôi cấy, nồng độ doxycycline và thời điểm kích hoạt cũng như thời điểm thêm các hóa chất thử nghiệm. Chúng tôi cũng đã kiểm soát sự bay hơi trong suốt quá trình ủ để giảm thiểu các ảnh hưởng ở mép đĩa. Trong quá trình tối ưu hóa, giá trị luminescence từ các tế bào chưa được kích thích được thiết lập để thể hiện 100% sự cứu rỗi và giá trị từ các kiểm soát được kích thích bởi doxycycline thể hiện 0% cứu rỗi. Điều này cho phép chuẩn hóa đáng tin cậy giữa các đĩa và cung cấp cho các hóa chất độc hại một giá trị âm còn các hóa chất cứu rỗi sự phát triển một giá trị dương với 100% có nghĩa là cứu rỗi hoàn toàn. Để định lượng khách quan cách các thay đổi của các tham số khác nhau cải thiện sự biến thiên ở cả tế bào bị kích thích và chưa bị kích thích, chúng tôi đã tính toán Z factor như được mô tả bởi Zhang et. al. (JBS, 1999). Z factor xem xét cả phạm vi và sự biến thiên của dữ liệu để tính toán sự phù hợp của một thử nghiệm cho việc sàng lọc cao thông lượng. Nó được đại diện như sau: (SD: Độ lệch chuẩn). Giá trị Z có ý nghĩa trong khoảng -1 < Z ≤ 1. Giá trị Z càng lớn, chất lượng dữ liệu càng cao và một Z-factor trên 0,5 được coi là rất vững chắc. Sau khi phát triển thử nghiệm, chúng tôi đã đến được các điều kiện được trình bày trong bảng, dẫn đến giá trị Z là 0,7: Môi trường nuôi cấy 100 ng/ml mSCF, 2 U/ml Epo, 100 nM dexamethasone trong môi trường không huyết tương. (doxycycline: 0,5 μg/ml). Ngày nuôi cấy 4 (thêm hóa chất thử nghiệm 24 giờ sau khi kích hoạt doxycycline) Số tế bào mỗi giếng 2000 (tế bào gan thai nhi chuột cKit+ với rps19-shRNA có thể kích hoạt) Đọc giá trị Phát hiện ATP dựa trên Luciferase (CellTiter-Glo¨). Đối với việc sàng lọc bao gồm các thư viện dựa trên phân tử nhỏ, chúng tôi đã thêm các hợp chất 24 giờ sau khi cấy tế bào và thêm doxycycline, cho phép kích hoạt kiểu hình phát triển bị phá vỡ. Chúng tôi đã xác thực thử nghiệm về mặt dược lý bằng cách kiểm tra và định lượng tác động của IL-3, một cytokine được biết là có tác động tích cực đến các tế bào tiền thân hồng cầu. IL-3 có giá trị cứu rỗi 25% trong thử nghiệm của chúng tôi. Các thí nghiệm đang diễn ra (>11.000 hợp chất đã được sàng lọc cho đến nay) cho thấy hơn 50% các hợp chất có điểm cứu rỗi >20% trong sàng lọc có thể được xác nhận là cứu rỗi sự phát triển trong các thí nghiệm phụ thuộc liều. Kết luận, chúng tôi đã thiết lập một thử nghiệm quy mô lớn vững mạnh để sàng lọc các phân tử cứu rỗi sự ngừng phát triển do thiếu hụt Rps19 trong các tiền thân hồng cầu chuột. Chúng tôi hiện đang sử dụng thử nghiệm này để sàng lọc các thư viện hóa học nhỏ trong tìm kiếm các hợp chất công cụ mới cho nghiên cứu DBA và các ứng viên thuốc cho điều trị DBA.