Infection and Immunity

Bordetella bronchiseptica is a pathogen of laboratory, domestic, and wild animals and sometimes of humans. In the present study some characteristics of the virulence of B. bronchiseptica isolates of different origin were studied. All isolates had similar phenotypes, similar bacteriological characters, and synthesized adenylate cyclase-hemolysin, filamentous hemagglutinin and pertactin but not pertussis toxin. These isolates, however, differed in their ability to express dermonecrotic toxin and to cause a lethal infection, but no correlation was found with the human or animal origin of the isolates. The fact that the most virulent isolate did not express dermonecrotic toxin suggests that this toxin does not play an important role in the virulence of the bacteria in the murine model. After infection with virulent B. bronchiseptica a very early synthesis and a persistence of anti-adenylate cyclase-hemolysin and anti-filamentous hemagglutinin antibodies were observed in the sera of infected mice, suggesting a persistence of the bacteria or of its antigens. B. bronchiseptica adenylate cyclase-hemolysin was purified and was shown to be a major protective antigen against B. bronchiseptica infection. Furthermore, we showed that its immunological and protective properties were different from that of B. pertussis adenylate cyclase-hemolysin, confirming that Bordetella species are immunologically different.

Kháng nguyên V của Yersinia pestis là một protein đa chức năng, đã được xác định có vai trò là một kháng nguyên bảo vệ, yếu tố virulence, và protein điều hòa. Một loạt các đoạn kháng nguyên V được biểu hiện dưới dạng protein ghép GST (GST-V truncates) đã được tinh sạch để hỗ trợ nghiên cứu tính miễn dịch và chức năng của kháng nguyên V. Các nghiên cứu tiêm chủng với GST-V truncates đã xác định hai vùng của kháng nguyên V có khả năng bảo vệ chống lại Y. pestis 9B (một loại vi khuẩn gây dịch hạch phổi hoàn toàn virulent ở người) trong mô hình chuột. Một vùng bảo vệ nhỏ được xác định từ acids amin 2 đến 135 (vùng I), và một vùng bảo vệ chính được tìm thấy giữa các acids amin 135 và 275 (vùng II). Thêm vào đó, phân tích tỷ lệ IgG sau khi tiêm chủng cho thấy vùng kháng nguyên chính của kháng nguyên V nằm giữa các acids amin 135 và 245. Một bộ kháng thể đơn dòng được tạo ra chống lại kháng nguyên V tái tổ hợp đã được đặc trưng bằng cách thực hiện Western blotting đối với GST-V truncates, và các epitopes của hầu hết các kháng thể đơn dòng đã được lập bản đồ đến vùng I hoặc II. Kháng thể đơn dòng 7.3, nhận diện một epitope trong vùng II, đã bảo vệ thụ động cho chuột chống lại thử thách với 12 liều gây chết trung bình của Y. pestis GB, cho thấy rằng vùng II mã hóa một epitope bảo vệ. Đây là báo cáo đầu tiên về một kháng thể đơn dòng đặc hiệu cho kháng nguyên V khi bảo vệ chuột chống lại một chủng Y. pestis hoàn toàn virulent. Do đó, phương pháp kết hợp giữa tiêm chủng thụ động và chủ động đã xác nhận tầm quan trọng của vùng trung tâm của protein để bảo vệ và cũng xác định một vùng bảo vệ chưa được biết đến trước đây ở đầu N của kháng nguyên V.

Nhiều mầm bệnh động vật và thực vật sử dụng hệ thống tiết loại III để tiết ra các yếu tố độc lực then chốt, một số được đưa trực tiếp vào lòng tế bào của vật chủ. Tuy nhiên, cơ sở cho việc di chuyển protein như vậy vẫn chưa được làm sáng tỏ hoàn toàn đối với bất kỳ hệ thống tiết loại III nào. Chúng tôi đã chỉ ra rằng trong các chủng Escherichia coli gây bệnh đường ruột và gây tiêu chảy có máu, protein được tiết ra qua loại III là EspA được lắp ráp thành một bào quan hình sợi bện, gắn kết vi khuẩn vào màng tế bào của vật chủ. Sự hình thành các sợi EspA phụ thuộc vào việc biểu hiện một protein được tiết ra khác theo kiểu III, EspD. Phần cuối carboxy của EspD, một protein tham gia vào việc tạo ra lỗ di chuyển trong màng tế bào của vật chủ, được dự đoán sẽ có dạng xoắn với xác suất lên tới 99%. Tại đây, chúng tôi chứng minh sự tương tác giữa các protein EspD-EspD bằng cách sử dụng hệ thống hai-hybrid nấm men và các lớp cột. Sự thay thế axit amin ba không bảo toàn của các khu vực đặc biệt ở tận cùng carboxy của EspD đã tạo ra một đột biến ở E. coli gây bệnh đường ruột bị giảm khả năng kích thích tạo ra tổn thương gắn kết và tẩy tế bào trên các tế bào HEp-2. Mặc dù đột biến này không ảnh hưởng đến sự tổng hợp sợi EspA, nhưng nó cũng dẫn đến việc giảm gắn kết và giảm tình trạng tan máu của các tế bào hồng cầu. Những kết quả này phân lập, lần đầu tiên, các miền chức năng của EspD điều khiển chiều dài sợi EspA khỏi sự gắn kết tế bào do EspD điều phối và việc hình thành lỗ.

Một số tác nhân gây bệnh ở đường hô hấp trên biểu hiện một cấu trúc prokaryotic không bình thường, phosphorylcholine (ChoP), trên bề mặt tế bào của chúng. Chúng tôi đã kiểm tra giả thuyết rằng ChoP, cũng được tìm thấy trên lipid màng của chủ thể dưới dạng phosphatidylcholine, hoạt động để giảm thiệt hại do các peptide chống vi sinh vật nhằm vào sự khác biệt giữa màng vi khuẩn và màng chủ. Trong Haemophilus influenzae, ChoP là một cấu trúc biến thiên theo giai đoạn trên phần oligosaccharide của lipopolysaccharide (LPS). Đã có tác động tiêu diệt của peptide LL-37/hCAP18 trên một chủng H. influenzae không có kiểu hình, với sự chọn lọc tăng dần cho pha ChoP⁺ khi nồng độ peptide tăng từ 0 lên 10 μg/ml. Hơn nữa, các đột biến biểu hiện ChoP liên tục từ các chủng không liên quan cho thấy khả năng sống sót cao hơn gấp 1.000 lần so với các đột biến không có ChoP. Tác động của ChoP đối với khả năng chống chịu sự tiêu diệt bởi LL-37/hCAP18 phụ thuộc vào nồng độ muối và chỉ được quan sát thấy khi vi khuẩn được nuôi trong sự hiện diện của choline môi trường, một điều kiện cần thiết để biểu hiện ChoP trên LPS. Các nghiên cứu tiếp theo đã xác định rằng có sự phiên mã của gen LL-37/hCAP18 trên bề mặt biểu mô của hầu họng người trong điều kiện tự nhiên và sự phiên mã có thể kích thích trong các tế bào biểu mô lấy từ đường hô hấp trên. Sự hiện diện của một lượng LL-37/hCAP18 rất biến thiên trong dịch tiết mũi bình thường (<1.2 đến >80 μg/ml) đã được chứng minh bằng một kháng thể chống lại peptide này. Kết luận rằng ChoP thay đổi bề mặt tế bào vi khuẩn để mô phỏng lipid màng của chủ thể và giảm thiểu sự tiêu diệt bởi LL-37/hCAP18, một peptide chống vi sinh vật có thể được biểu hiện trên bề mặt niêm mạc của hầu họng với nồng độ diệt khuẩn.

β-Defensins là các peptide cation có hoạt tính kháng khuẩn rộng rãi được sản xuất bởi các biểu mô ở bề mặt niêm mạc. Hai loại β-defensins của người, HBD-1 và HBD-2, đã được phát hiện vào năm 1995 và 1997. Tuy nhiên, rất ít thông tin về sự biểu hiện của HBD-1 hoặc HBD-2 trong mô của khoang miệng và liệu các protein này có được tiết ra hay không. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã xác định sự biểu hiện của mARN HBD-1 và HBD-2 trong các tuyến nước bọt lớn, lưỡi, lợi và niêm mạc má, và phát hiện các peptide β-defensin trong nước bọt. Sự biểu hiện mARN defensin được định lượng bằng các thử nghiệm bảo vệ RNase. Sự biểu hiện mARN HBD-1 được phát hiện ở lợi, tuyến mang tai, niêm mạc má và lưỡi. Sự biểu hiện mARN HBD-2 chỉ được phát hiện ở niêm mạc lợi và phong phú nhất trong các mô có viêm liên quan. Để kiểm tra xem sự biểu hiện β-defensin có thể kích thích hay không, các mẫu tế bào keratinocyte lợi đã được điều trị bằng interleukin-1β (IL-1β) hoặc lipopolysaccharide (LPS) trong 24 giờ. Sự biểu hiện HBD-2 tăng khoảng 16 lần với điều trị IL-1β và khoảng 5 lần trong sự hiện diện của LPS. Kỹ thuật Western immunoblotting, sắc ký lỏng và khối phổ đã được sử dụng để xác định các peptide HBD-1 và HBD-2 trong nước bọt của người. Các β-defensins của người được biểu hiện trong các mô miệng và các protein này được tiết ra trong nước bọt; sự biểu hiện của HBD-1 là liên tục, trong khi sự biểu hiện của HBD-2 bị kích thích bởi IL-1β và LPS. Các β-defensins của người có thể đóng một vai trò quan trọng trong các cơ chế phòng thủ tự nhiên chống lại các vi sinh vật ở miệng.

β-Defensins là các peptide mang điện tích dương với hoạt tính kháng khuẩn phổ rộng, có thể đóng vai trò trong hệ thống phòng thủ niêm mạc của một số cơ quan. Chúng đã được phân lập ở nhiều loài, và trong cơ thể người, hai loại β-defensins đã được xác định. Ở đây, chúng tôi báo cáo việc xác định hai gen mã hóa các đồng loại β-defensin ở chuột đồng. Các cDNA một phần được phát hiện qua việc tìm kiếm cơ sở dữ liệu nhãn gắn chuỗi biểu hiện, và các mồi được thiết kế để tạo ra các chuỗi mã hóa mRNA đầy đủ. Một gen có độ tương đồng cao với gen β-defensin-1 ở người (HBD-1) và gen β-defensin-1 ở chuột (mouse) cả về cấp độ axit nucleic và axit amin, và được gọi là β-defensin-1 ở chuột đồng (RBD-1). Gen còn lại, được đặt tên là RBD-2, có tính đồng nhất với HBD-2 và gen peptide kháng khuẩn trong khí quản bò (TAP). Các prepropeptides dự đoán có tính điện tích dương mạnh, dài 69 và 63 acid amin đối với RBD-1 và RBD-2, tương ứng, và chứa motif sáu cysteine đặc trưng của β-defensins. Các gen β-defensin được xác định chỉ ra gần gũi trên nhiễm sắc thể 16 của chuột đồng và có mối liên kết chặt chẽ với các gen α-defensins, cho thấy rằng chúng là một phần của một cụm gen, tương tự như cấu trúc được báo cáo ở người. Phân tích Northern blot cho thấy cả hai bản sao mRNA của RBD-1 và RBD-2 có chiều dài khoảng 0.5 kb; mRNA của RBD-1 được phiên mã phong phú trong thận của chuột đồng, trong khi RBD-2 phổ biến ở phổi. Phân tích phản ứng chuỗi polymerase phiên mã ngược cho thấy rằng mRNA của RBD-1 và RBD-2 phân bố trong nhiều mô khác nhau. Tại phổi, sự biểu hiện mRNA của RBD-1 được xác định tại biểu mô khí quản trong khi RBD-2 được biểu hiện trong các tế bào loại II phế nang. Tóm lại, chúng tôi đã đặc trưng hóa hai đồng loại β-defensin mới ở chuột đồng. Chuột đồng có thể là một mô hình hữu ích để điều tra chức năng và đóng góp của β-defensins vào sự phòng thủ của vật chủ trong phổi, thận và các mô khác.

Các tế bào biểu mô nướu miệng của con người (HGE) thể hiện hai peptide kháng khuẩn thuộc họ β-defensin, human β-defensin 1 (hBD-1) và hBD-2, cũng như các cytokine và chemokine góp phần vào miễn dịch bẩm sinh. Trong nghiên cứu hiện tại, sự biểu hiện và điều hòa phiên mã của hBD-2 đã được xem xét. HBD-2 mRNA được kích thích bởi chiết xuất thành tế bào của Fusobacterium nucleatum, một vi sinh vật cộng sinh trong miệng, nhưng không bởi Porphyromonas gingivalis, một tác nhân gây bệnh nha chu. HBD-2 mRNA cũng được kích thích bởi cytokine proinflammatory yếu tố hoại tử khối u alpha (TNF-α) và phorbol myristate acetate (PMA), một tác nhân kích hoạt tế bào biểu mô. HBD-2 mRNA cũng được biểu hiện trong 14 trong số 15 mẫu mô nướu không viêm. Peptide HBD-2 được phát hiện bằng phương pháp miễn dịch huỳnh quang trong HGE được kích thích bằng thành tế bào F. nucleatum, nhất quán với việc kích thích mRNA bởi tác nhân này. Phân tích động học cho thấy sự tham gia của nhiều con đường tín hiệu khác nhau trong việc điều hòa hBD-2 mRNA; TNF-α và thành tế bào F. nucleatum đã kích thích hBD-2 mRNA nhanh chóng (2 đến 4 giờ), trong khi kích thích bằng PMA chậm hơn (∼10 giờ). Ngược lại, mỗi tác nhân đã kích thích interleukin 8 (IL-8) trong vòng 1 giờ. Vai trò của TNF-α như một trung gian trong tín hiệu của F. nucleatum đã được loại trừ bởi việc bổ sung anti-TNF-α không cản trở sự kích thích hBD-2. Tuy nhiên, các nghiên cứu về chất ức chế cho thấy rằng việc kích thích hBD-2 mRNA bởi F. nucleatum yêu cầu cả phiên mã gen mới và tổng hợp protein mới. Các lipopolysaccharides của vi khuẩn được tách chiết từ Escherichia coli và F. nucleatum là những tác nhân kích thích hBD-2 kém, mặc dù chúng đã tăng cường mRNA IL-8. Tóm lại, phát hiện của chúng tôi cho thấy sự biểu hiện kích thích của hBD-2 mRNA qua nhiều con đường trong HGE với một mẫu hình khác biệt với biểu hiện IL-8. Chúng tôi đề xuất rằng các khía cạnh khác nhau của phản ứng miễn dịch bẩm sinh được điều hòa khác nhau và rằng các vi sinh vật cộng sinh có vai trò trong việc kích thích các tế bào biểu mô niêm mạc trong việc duy trì hàng rào góp phần vào sự ổn định và phòng vệ của cơ thể.

Có hai cơ chế quan trọng trong việc kích hoạt tế bào T tự nhiên không biến đổi (tế bào iNKT) bởi vi sinh vật: kích hoạt trực tiếp thụ thể tế bào T (TCR) bởi các glycosid vi sinh vật được trình diện bởi CD1d và kích hoạt gián tiếp, được trung gian bởi phản ứng của các tế bào trình diện kháng nguyên với vi sinh vật. Trong nghiên cứu này, chúng tôi cung cấp bằng chứng về một cơ chế kích hoạt trực tiếp tế bào iNKT độc lập với CD1d thông qua một siêu kháng nguyên protein vi sinh vật được trình diện trong bối cảnh của phức hợp tương thích mô chính lớp II (MHC-II), đóng vai trò then chốt trong sinh bệnh học, từ đó định nghĩa lại vai trò của tế bào iNKT. Sự tiếp xúc qua đường mũi với độc tố ruột tụ cầu vàng B (SEB) ở chuột C57BL/6 kiểu hoang dã gây ra tổn thương phổi cấp tính (ALI) được đặc trưng bởi rò rỉ mạch máu, bão cytokine và sự xâm nhập của các tế bào đơn nhân trong phổi. Ngược lại, sự rò rỉ mạch máu và viêm đã giảm khoảng 50% ở những con chuột thiếu tế bào NKT Jα18^−/− và CD1d^−/− sau khi tiếp xúc với SEB, điều này đã được đảo ngược sau khi chuyển giao tế bào iNKT vào chuột CD1d^−/−. Trong ống nghiệm, SEB có thể kích thích trực tiếp tế bào iNKT theo cách độc lập với CD1d thông qua tương tác MHC-II/TCR, đặc biệt liên quan đến Vβ8. Những nghiên cứu này không chỉ chứng minh rằng tế bào iNKT có thể được kích hoạt trực tiếp bởi một siêu kháng nguyên protein vi khuẩn độc lập với CD1d mà còn chỉ ra rằng ngoài các tế bào T thông thường, tế bào iNKT đóng vai trò then chốt trong ALI do SEB trung gian.

Kháng thể đối với nhiễm trùng do Legionella pneumophila chủ yếu phụ thuộc vào miễn dịch tế bào hơn là miễn dịch huyết thanh. Bằng chứng gần đây cho thấy sự kích hoạt miễn dịch tế bào phụ thuộc vào tế bào Th1 và kích hoạt miễn dịch huyết thanh phụ thuộc vào tế bào Th2. Trong báo cáo này, delta 9-tetrahydrocannabinol (THC), cannabinoid gây ảo giác chính của cần sa và là một chất điều hòa miễn dịch, đã làm giảm sự phát triển của miễn dịch thứ cấp đối với L. pneumophila, điều này tương quan với sự giảm hoạt động của Th1. Chuột BALB/c, bị nhiễm một liều tối thiểu ban đầu của L. pneumophila, phát triển khả năng kháng lại một nhiễm trùng thử thách lớn hơn sau 3 đến 4 tuần. Tuy nhiên, việc tiêm THC bằng đường tĩnh mạch (4 mg/kg trọng lượng cơ thể) 1 ngày trước nhiễm trùng ban đầu đã dẫn đến tỷ lệ tử vong cao hơn sau nhiễm trùng thử thách. Mức độ kháng thể chống L. pneumophila trong huyết thanh tăng lên ở cả chuột được điều trị THC và nhóm kiểm soát; tuy nhiên, trong nhóm THC, kháng thể IgG1, được kích thích bởi tế bào Th2, đã tăng lên, trong khi kháng thể IgG2a, do Th1 điều hòa, thì bị giảm. Hơn nữa, các tế bào lách nuôi cấy từ chuột được điều trị THC có khả năng sinh sản lympho đặc hiệu L. pneumophila thấp hơn, chỉ ra rằng có sự thiếu hụt trong miễn dịch tế bào. Các tế bào lách chuột bình thường được điều trị in vitro với THC và mitogen pokeweed cho thấy sản xuất gamma interferon, một cytokine liên quan đến tế bào Th1, bị ức chế, nhưng sản xuất interleukin 4, một cytokine do tế bào Th2 sản xuất, lại tăng lên. Các tế bào lách từ chuột được điều trị THC, kích thích in vitro bằng cả mitogen pokeweed hoặc kháng thể anti-CD3, cũng sản xuất ít gamma interferon hơn, cho thấy hoạt động Th1 giảm ở những con chuột này. Kết quả này gợi ý rằng THC giảm sự phát triển của miễn dịch chống lại L. pneumophila bằng cách gây ra sự thay đổi trong cân bằng hoạt động của Th1 và Th2.