FEBS Journal

Post‐translational maturation of soluble cytochrome c includes translocation of the precursor polypeptide and heme through the cytoplasmic membrane, proteolytic cleavage of the signal sequence, and cova‐lent attachment of heme. Specific genes for cytochrome c maturation (ccmABCDEFGH in Escherichia coli) are required for holocytochrome c formation, among them genes encoding an ABC transporter (ccmABC). We investigated the requirements of apocytochrome translocation to the periplasm and characterized specific intermediates of the cytochrome c maturation pathway. Apocytochrome precursor was present in the membrane fraction. Translocation of the polypeptide was independent of ccm gene products, but dependent on a functional secretion machinery, as shown by accumulation of preapocytochrome c in the membranes of secA and secY mutants. After translocation, cleavage of the signal sequence allowed the release of apocytochrome into the periplasm, where heme was bound in a ccm‐dependent manner. By contrast, non‐cleaved holocytochrome c containing covalently bound heme accumulated in the membranes of a lepB mutant, which indicated that signal sequence cleavage and heme attachment are independent steps in the cytochrome c maturation pathway.

A hemolysin, θ‐toxin, produced by Clostridium perfringens has one cysteinyl residue in the free thiol form which is essential for its hemolytic activity. The cysteinyl residue was shown to be located at a position about 5 kDa from the C terminus of the molecule by the method of cysteine‐specific chemical cleavage. Modification of the residue with a thiol‐blocking agent, 5,5′‐dithiobis(2‐nitrobenzoic acid), reduced the binding affinity of the toxin to sheep erythrocytes to 1/100 that of intact toxin, resulting in a failure of binding at low cell concentrations (0.5%). Thus the failure of hemolysis at low cell concentrations is primarily ascribed to a decreased affinity of the toxin for erythrocytes. Effects of the modification on the lytic processes were examined using high cell concentrations where considerable amounts of modified toxin bound to the cells. The modified toxin hemolyzes erythrocytes once it binds to them; however, the efficiency of hemolysis is reduced by the modification. These, and additional results indicating that modification alters the sensitivity of toxin molecules to protease digestion, show that thiol‐modification inactivates the toxin by affecting both binding and the subsequent lytic processes, probably through a conformational change introduced in the toxin molecules.

We have analyzed the core promoter element of the Na⁺/K⁺‐ATPase α1 subunit gene by means of an in vitro transcription system composed of a HeLa nuclear extract. 5′‐deletion and 3′‐deletion analyses revealed that this gene is specifically transcribed by RNA polymerase II in a manner that is dependent on the upstream regulatory region of the gene (−102 to −61), and that the 3′ boundary of the minimal promoter element does not extend beyond +5. Analysis of linker‐substitution mutations and point mutations revealed that the TATA‐like sequence (−33 to −26) is required for upstream‐sequence‐dependent transcription whereas linker‐substitution mutations and point mutations near +1 did not abolish transcription.

The gene was found to be transcribed by RNA polymerase III when phosphocellulose column fractions were assayed. Deletion analysis mapped the minimal RNA‐polymerase‐III–specific promoter element from −49 to +17. The phosphocellulose 0.3‐M‐KCl fraction is absolutely required for transcription by RNA polymerase III, while the 0.85‐M‐KCl fraction represses aberrant transcription from incorrect initiation sites. Analysis of linker‐substitution mutations indicated that the TATA‐like sequence is required for RNA‐polymerase‐III–specific transcription. Although point mutations in the 5′ half of the TATA‐like sequence did not affect transcription, those in the 3′ half shifted the transcription initiation site 3 bp upstream. The results suggest that the Na⁺/K⁺‐ATPase α1 subunit gene promoter contains a TATA‐like sequence which can direct transcription by RNA polymerase III in vitro. The mechanism of alternative regulation of RNA polymerase II and RNA polymerase III is discussed.

Bảo vệ tế bào chống lại các tác động có hại của các chất oxy hóa phản ứng được sinh ra trong chuyển hóa hiếu khí, gọi là stress oxy hóa, được tổ chức ở nhiều cấp độ khác nhau. Các chiến lược phòng thủ bao gồm ba cấp độ bảo vệ: ngăn ngừa, chặn lại và sửa chữa. Việc điều chỉnh khả năng chống oxy hóa bao gồm việc duy trì mức độ hợp lý của các chất chống oxy hóa và vị trí của các hợp chất và enzyme chống oxy hóa. Sự thích nghi ngắn hạn và dài hạn cũng như chuyên biệt hóa tế bào trong các chức năng này là những lĩnh vực quan tâm mới. Kiểm soát hoạt động của các enzyme gây oxy hóa, chẳng hạn như NADPH oxidase và NO synthases, là rất quan trọng. Các chất chống oxy hóa tổng hợp mô phỏng các chiến lược sinh học.

Theo giả thuyết tín hiệu, một chuỗi tín hiệu, sau khi khởi đầu xuất khẩu của một chuỗi protein đang tăng trưởng qua mạng lưới nội chất thô, sẽ được cắt ra khỏi protein trưởng thành tại một vị trí cụ thể. Đã có một thời gian dài cho rằng một phần của tính đặc hiệu cắt gắn liền với dư lượng cuối cùng của chuỗi tín hiệu, và nó luôn là một dư lượng chứa chuỗi bên nhỏ, không mang điện. Tuy nhiên, cho đến nay, chưa phát hiện được thêm các mẫu cụ thể về amin gần điểm cắt. Trong bài báo này, một số mẫu như vậy, dựa trên một mẫu 78 chuỗi tín hiệu eukaryotic, được trình bày và thảo luận, cùng với nỗ lực đầu tiên trong việc xây dựng quy tắc để dự đoán các vị trí cắt.

Thioredoxin, thioredoxin reductase và NADPH, hệ thống thioredoxin, tồn tại phổ biến từ Archea đến con người. Thioredoxin, với vị trí hoạt động dithiol/disulfide (CGPC) là các khử disulfide protein chính trong tế bào; do đó, chúng cũng đóng vai trò là don electron cho các enzyme như ribonucleotide reductases, thioredoxin peroxidases (peroxiredoxins) và methionine sulfoxide reductases. Glutaredoxins xúc tác phản ứng oxy hóa-khử glutathione-disulfide, chồng lắp chức năng của thioredoxins và sử dụng electron từ NADPH thông qua glutathione reductase. Các isoform thioredoxin có mặt ở hầu hết các sinh vật và ti thể có một hệ thống thioredoxin riêng biệt. Cây có thioredoxin trong lục lạp, mà thông qua ferredoxin-thioredoxin reductase điều chỉnh các enzyme quang hợp bằng ánh sáng. Thioredoxins rất quan trọng cho sự điều hòa redox của chức năng protein và tín hiệu thông qua kiểm soát redox thiol. Số lượng ngày càng tăng của các yếu tố phiên mã như NF-κB hoặc AP1 phụ thuộc vào Ref-1 đòi hỏi sự khử thioredoxin để gắn DNA. Thioredoxin trong tế bào chất của động vật có vú, thiếu hụt gây chết phôi, có nhiều chức năng trong việc chống lại stress oxy hóa, kiểm soát tăng trưởng và apoptosis, nhưng cũng được tiết ra và có hoạt động đồng-cytokine và chemokine. Thioredoxin reductase là một flavoprotein dimmer đặc hiệu 70-kDa ở vi khuẩn, nấm và thực vật với vị trí hoạt động redox disulfide/dithiol. Ngược lại, thioredoxin reductases ở động vật bậc cao lớn hơn (112-130 kDa), phụ thuộc selen, là flavoproteins dimmer với đặc điểm cơ chất rộng rãi, cũng khử các cơ chất không thuộc disulfide như hydroperoxides, vitamin C hoặc selenite. Tất cả các isozyme thioredoxin reductase của động vật có vú đều đồng hình với glutathione reductase và có một đuôi C-terminus được bảo tồn với chuỗi cysteine-selenocysteine hình thành vị trí hoạt động selenenylsulfide/selenolthiol hoạt động redox và bị ức chế bởi goldthioglucose (aurothioglucose) và các thuốc được sử dụng lâm sàng khác.

Một quy trình được mô tả để tinh chế quy mô lớn RNA mRNA chuỗi nhẹ (L) và chuỗi nặng (H) từ các khối u plasmacytoma được sản xuất ở chuột. RNA nguyên vẹn được kết tủa chọn lọc với hiệu suất cao từ các khối u đông lạnh được đồng hóa trong 3 M LiCl và 6 M urê. RNA mRNA chuỗi L và H được tinh chế bằng sắc ký oligo(dT)-cellulose và hoặc bằng ly tâm gradient sucrose trong các điều kiện ngăn ngừa sự kết tụ hoặc bằng phương pháp điện di gel chuẩn bị phân giải cao trong điều kiện không biến tính. RNA mRNA γ2a và α chuỗi nặng lắng đọng như các thành phần chính ở 15,5 S và 16,5 S tương ứng, khi RNA mRNA chuỗi L lắng đọng ở dạng 12-S. RNA mRNA chuỗi H được tách ra bằng cách rửa liên tục trong quá trình điện di gel chuẩn bị hoàn toàn phân lập khỏi cả RNA mRNA chuỗi L và rRNA 18-S còn lại, và di chuyển như các thành phần đơn lẻ có kích thước 1900 ± 50 nucleotide trên các gel phân giải biệt hóa phân tích. Các RNA mRNA chuỗi H đã được tinh chế một phần được dịch mã thành các thành phần chính có trọng lượng phân tử 56000 (γ2a) và 60000 (α) trong lysate reticulocyte thỏ phụ thuộc vào mRNA, trong khi RNA mRNA chuỗi L tạo ra các polypeptide có trọng lượng phân tử 25000 (λ) và 27000 (к). Tối đa 95% các sản phẩm dịch mã do các mRNA tinh chế hướng dẫn đã được kết tủa miễn dịch bằng cách sử dụng huyết thanh kháng thể đặc hiệu. Độ tinh khiết của các RNA mRNA chuỗi L và H được đánh giá bằng cách lai cDNA tương ứng với DNA plasmid tái tổ hợp dư thừa. Các kết quả cho thấy độ tinh khiết tối thiểu là 47% (γ2a), 62% (α) đối với RNA mRNA chuỗi H và 60% (к) đối với RNA mRNA chuỗi L.

Máy xác định chuỗi protein là một thiết bị dùng để xác định tự động các chuỗi axit amin trong protein và peptide. Thiết bị hoạt động dựa trên nguyên tắc của sơ đồ phân hủy phenylisothiocyanate. Quy trình tự động bao gồm việc hình thành dẫn xuất phenylthiocarbamyl của protein và việc cắt tách axit amin N‐terminal dưới dạng thiazolinone. Quá trình phân hủy diễn ra với tốc độ 15.4 chu kỳ trong 24 giờ và với tỷ lệ thu được trong từng chu kỳ vượt quá 98%. Các yêu cầu về vật liệu khoảng 0.25 μmol protein. Các thiazolinone được chuyển đổi thành phenylthiohydantoins tương ứng trong một quy trình riêng biệt, và các dẫn xuất này được xác định bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng. Quy trình đã được áp dụng cho phân tử toàn bộ của apomyoglobin từ cá kình, và có thể xác định được chuỗi của 60 axit amin đầu tiên từ đầu N‐terminal.

Chúng tôi đã chỉ ra rằng Alamar Blue chính là resazurin. ‘Thử nghiệm giảm resazurin’ đã được sử dụng trong khoảng 50 năm để theo dõi sự ô nhiễm vi khuẩn và nấm men trong sữa, cũng như để đánh giá chất lượng tinh trùng. Resazurin (màu xanh và không phát quang) được giảm thành resorufin (màu hồng và phát quang mạnh) và tiếp tục được giảm thành hydroresorufin (không màu và không phát quang). Vẫn chưa biết quá trình giảm này xảy ra như thế nào, bên trong tế bào thông qua hoạt động enzyme hay trong môi trường như một phản ứng hóa học, mặc dù dạng huỳnh quang đã được giảm của Alamar Blue đã được phát hiện trong tế bào chất và trong nhân của các tế bào sống và tế bào chết. Gần đây, thuốc nhuộm này đã trở nên phổ biến như một cách rất đơn giản và linh hoạt để đo lường sự phát triển của tế bào và tính độc tế bào. Thuốc nhuộm này có nhiều ưu điểm so với các thử nghiệm độc tế bào hay phát triển tế bào khác, nhưng chúng tôi đã quan sát thấy một số nhược điểm trong việc sử dụng Alamar Blue thường xuyên. Các thử nghiệm với một số chất độc hại trên các dòng tế bào khác nhau và tế bào gan sơ cấp của chuột đã cho thấy sự tích lũy sản phẩm huỳnh quang của Alamar Blue trong môi trường, điều này có thể dẫn đến việc ước lượng quá mức về dân số tế bào. Hơn nữa, việc giảm mạnh Alamar Blue bởi các tế bào có hoạt động trao đổi chất dẫn đến một sản phẩm cuối không phát quang, vì vậy có thể dẫn đến việc ước lượng thấp về hoạt động tế bào.