British Journal of Pharmacology

Changing pH_o from 7.4 to 6.4 or 8.4 produced a depolarisation or hyperpolarisation, respectively, in mesenteric and pulmonary arteries. Anandamide (10 μM) or bupivacaine (100 μM) reversed the hyperpolarisation associated with alkaline pH_o, shifting the E_M of both vessels to levels comparable to that at pH 6.4. In pulmonary arteries, clofilium (100 μM) caused a significant reversal of hyperpolarisation seen at pH 8.4 but was without effect at pH 7.4.

K⁺ channel blockade by 4‐aminopyridine (4‐AP) (5 mM), tetraethylammonium (TEA) (10 mM), Ba²⁺ (30 μM) and glibenclamide (10 μM) depolarised the pulmonary artery. However, shifts in E_M with changes in pH_o remained and were sensitive to anandamide (10 μM), bupivacaine (100 μM) or Zn²⁺ (200 μM).

Anandamide (0.3–60 μM) or bupivacaine (0.3–300 μM) caused a concentration‐dependent increase in basal tone in pulmonary arteries.

RT–PCR demonstrated the expression of TASK‐1, TASK‐2, THIK‐1, TRAAK, TREK‐1, TWIK‐1 and TWIK‐2 in mesenteric arteries and TASK‐1, TASK‐2, THIK‐1, TREK‐2 and TWIK‐2 in pulmonary arteries. TASK‐1, TASK‐2, TREK‐1 and TWIK‐2 protein was demonstrated in both arteries by immunostaining.

These experiments provide evidence for the presence of two‐pore domain K⁺ channels in rat mesenteric and pulmonary arteries. Collectively, they strongly suggest that modulation of TASK‐1 channels is most likely to have mediated the pH‐induced changes in membrane potential observed in these vessels, and that blockade of these channels by anandamide or bupivacaine generates a small increase in pulmonary artery tone.

Kích thích điện trường (EFS) trên các dải tròn của niệu đạo gần chuột đồng được tiền co lại bằng arginine vasopressin (AVP 10⁻⁸ m), và trong sự hiện diện của phentolamine (10⁻⁶ m), propranolol (10⁻⁶ m) và atropine (10⁻⁶ m), đã gây ra sự giãn theo tần số, điều này bị giảm bởi suramin (10⁻⁴ m) và reactive blue 2 (RB2; 2×10⁻⁴ m), nhưng không bị ảnh hưởng bởi pyridoxalphosphate-6-azophenyl-2′,4′-disulphonic acid (PPADS; 10⁻⁴ m), α-chymotrypsin (10–50 u ml⁻¹) hay bởi đối kháng VIP, [Lys¹, Pro^2,5, Arg^3,4, Tyr⁶]‐VIP, (5×10⁻⁷–10⁻⁶ m). Trong sự hiện diện của indomethacin (10⁻⁶ m), sự giãn theo tần số đối với EFS được tăng cường, đặc biệt ở các tần số kích thích thấp hơn. Sự giãn do EFS gây ra bị chặn bởi tetrodotoxin (10⁻⁶ m), cho thấy nguồn gốc thần kinh của nó.

ATP ngoại sinh (10⁻⁷–10⁻³ m) đã tạo ra các phản ứng giãn theo nồng độ, bị giảm bởi các đối kháng P2-purinoceptor là suramin (10⁻⁴ m) và RB2 (2×10⁻⁴ m) nhưng không bị ảnh hưởng bởi PPADS (10⁻⁴ m). Sự giãn do ATP gây ra cũng bị giảm đáng kể bởi indomethacin (10⁻⁶ m). Các phản ứng ức chế đối với ATP là độc lập với urothelium và NO, vì chúng không bị ảnh hưởng bởi việc loại bỏ urothelium hay bởi l-NAME (10⁻⁴ m).

VIP ngoại sinh (10⁻⁹–10⁻⁷ m) đã gây ra các phản ứng giãn theo nồng độ mà không bị ảnh hưởng bởi việc loại bỏ urothelium, l-NAME (10⁻⁴ m), α-chymotrypsin (10–50 u ml⁻¹) hoặc bởi [Lys¹, Pro^2,5, Arg^3,4, Tyr⁶]‐VIP (3×10⁻⁷–10⁻⁶ m). Tuy nhiên, suramin (10⁻⁴ m) và RB2 (2×10⁻⁴ m) nhưng không phải PPADS (10⁻⁴ m) đã kìm chế các phản ứng giãn do VIP gây ra. Peptide liên quan đến gen calcitonin (CGRP: 10⁻⁹–10⁻⁷ m) không có ảnh hưởng nào hoặc chỉ tác động một phản ứng giãn nhỏ trong các dải được tiền co lại bằng AVP.

Prostaglandin E₂ (PGE₂; 10⁻⁹–3×10⁻⁶ m) và tác nhân cho NO, sodium nitroprusside (SNP; 10⁻⁸–3×10⁻⁵ m) đã gây ra sự giãn theo nồng độ ở niệu đạo gần chuột đồng mà không bị giảm bởi suramin (10⁻⁴ m), RB2 (2×10⁻⁴ m) hoặc bởi PPADS (10⁻⁴ m), cho thấy hiệu ứng ức chế cụ thể của các đối kháng đã sử dụng.

Tóm lại, các kết quả này phù hợp với quan điểm rằng ATP là một chất truyền dẫn ức chế được giải phóng từ các dây thần kinh ức chế cung cấp sự giãn NANC của niệu đạo gần chuột đồng. Hiệu ứng giãn của ATP là độc lập với NO và urothelium. Nghiên cứu hiện tại không chứng minh rằng VIP được giải phóng từ các dây thần kinh phó giao cảm trong quá trình EFS, vì cả α-chymotrypsin và [Lys¹, Pro^2,5, Arg^3,4, Tyr⁶]‐VIP đều không có hiệu quả trên các phản ứng thần kinh.

EFS gây ra các cơn co rút phụ thuộc vào tần số ở tất cả các mẫu niệu đạo, nhưng trong sự hiện diện của guanethidine và atropine, EFS đã gây ra sự thư giãn đáng kể trong niệu đạo gần và không có tác động đến niệu đạo xa.

Trong sự hiện diện của guanethidine, atropine và N^G‐nitro‐L‐arginine methyl ester, các cơn co nhỏ đến EFS đã được thiết lập lại trong niệu đạo gần, nhưng không phải trong niệu đạo xa. N^G‐nitro‐D‐arginine methyl ester không có tác động như vậy.

Trong sự hiện diện của guanethidine, atropine và N^G‐nitro‐L‐arginine methyl ester, việc bổ sung L‐arginine đã phục hồi phản ứng thư giãn do EFS gây ra đã thấy trước đó với guanethidine và atropine một mình trong niệu đạo gần (tại 30 Hz; 12.89 ± 5.27% đến −2.44 ± 4.43%, trung bình ± s.e., P<0.05). D‐Arginine không có tác động như vậy.

Trong niệu đạo xa, việc bổ sung N^G‐nitro‐L‐arginine methyl ester và sau đó là L‐arginine không có tác động đến các phản ứng với EFS trong các mẫu đã được điều trị bằng guanethidine và atropine.

Sodium nitroprusside gây ra sự thư giãn ở cả niệu đạo gần và niệu đạo xa. Các phản ứng thư giãn trên mỗi cm² diện tích mặt cắt ngang ở niệu đạo gần và xa lần lượt là 1.23 ± 0.29 và 2.02 ± 0.54 g cm⁻² diện tích mặt cắt ngang (trung bình ± s.e.), không có sự khác biệt đáng kể giữa chúng.

Các neuron dương tính với cả NOS và NADPH diaphorase đều có mặt trong niệu đạo chó, với mật độ cả hai cao hơn trong niệu đạo gần so với niệu đạo xa.

Những kết quả này cho thấy niệu đạo chó cái có các dây thần kinh NOS và rằng NO nội sinh có thể đóng vai trò trong sự thư giãn ở niệu đạo gần nhưng không phải niệu đạo xa.

Một nghiên cứu miễn dịch mô học cho thấy có các dây thần kinh phản ứng với nitric oxide synthase ở lớp cơ trơn và trong lamina propria, ngay bên dưới lớp niệu biểu, nhưng không có dấu hiệu sinh nitric oxide (NOS) trong lớp niệu biểu.

Noradrenaline gây ra sự co thắt đáng kể hơn ở các dải không có niệu biểu so với các dải đối chứng. L‐NAME (10⁻⁴ m) không ảnh hưởng đến sự co thắt do noradrenaline gây ra ở cả hai dải đối chứng và dải không có niệu biểu. Phản ứng co thắt với acetylcholine không phụ thuộc vào sự hiện diện hay vắng mặt của lớp niệu biểu. Tuy nhiên, phản ứng do acetylcholine ngoại sinh (10⁻³ m) gây ra đã được tăng cường bởi L‐NAME (10⁻⁴ m), cả ở các dải còn nguyên vẹn và ở các dải không có niệu biểu.

Prostaglandin E₂ (10⁻⁸‐5 × 10⁻⁶ m) và 2‐methyl‐thio‐ATP (10⁻⁹‐10⁻⁵ m) đã thư giãn niệu đạo gần cụt. Suramin (10⁻⁴ m) đã ức chế đáng kể sự thư giãn do 2‐methyl‐thio‐ATP gây ra. Biên độ của những phản ứng này không khác biệt đáng kể giữa các dải còn nguyên vẹn và các dải không có niệu biểu và không bị chặn bởi L‐NAME (10⁻⁴ m).

Các kết quả này gợi ý rằng nitric oxide (NO) là chất truyền dẫn chính liên quan đến sự thư giãn không adrenergic, không cholinergic (NANC) của niệu đạo gần cụt hamster, có thể cùng với một chất truyền dẫn ức chế khác được giải phóng từ các dây thần kinh. NO có thể được giải phóng từ các dây thần kinh nằm trong lớp cơ trơn hình tròn và trong lamina propria thay vì trong lớp niệu biểu. Sự giảm thiểu thư giãn thần kinh ở các chế phẩm không có niệu biểu gợi ý rằng một yếu tố ức chế phụ thuộc NO được giải phóng từ lớp niệu biểu. Ngoài ra, ATP và prostaglandin E₂ có thể tham gia, cùng với NO, trong niệu đạo trong quá trình tiểu tiện.

Hoạt động NOS-miễn dịch và NADPH diaphorase được biểu hiện trong các thân dây thần kinh và các sợi thần kinh mảnh bên trong hoặc quanh các bó cơ trong bàng quang, ba đào và niệu đạo. Các sợi thần kinh mảnh phân tán bên trong các bó cơ chủ yếu được tìm thấy trong khu vực niệu đạo/ba đào, trong khi các sợi như vậy ít phổ biến hơn trong bàng quang.

Hầu như tất cả các cấu trúc thần kinh được nhuộm NOS cũng được nhuộm cho NADPH diaphorase. Ngược lại, urothelium, được nhuộm một cách mạnh mẽ bằng phương pháp NADPH diaphorase, lại không nhuộm bằng kỹ thuật hóa mô miễn dịch.

Kích thích điện trường của các chuẩn bị ba đào và niệu đạo lợn đã gây ra sự thư giãn, bị ức chế bởi tetrodotoxin (1 μm) và N^G-nitro-l-arginine (l-NOARG, 10 μm).

l-Arginine (1 mm), nhưng không phải d-arginine, đã ức chế (25–30%) các cơn co thắt bàng quang được kích thích điện. Sự ức chế này đã được đảo ngược bằng l-NOARG (0.1 mm). l-Arginine không ức chế các cơn co thắt bàng quang trong sự hiện diện của scopolamine (1 μm) và không có tác động trực tiếp đến cơ trơn per se.

Acetylcholine (1 nm − 10 μm) đã gây ra sự thư giãn phụ thuộc vào nồng độ của các co thắt do noradrenaline gây ra trong các động mạch bàng quang của lợn. Việc loại bỏ nội mô gần như xóa bỏ sự thư giãn do acetylcholine gây ra. Điều trị trước bằng l-NOARG (0.1 mm và 0.3 mm) đã gây ra sự chuyển dịch về phía bên phải của các đường cong nồng độ-phản ứng đối với acetylcholine, nhưng sự thư giãn tối đa đạt được giảm đáng kể (đến 65 ± 12%; n = 6; P < 0.05) chỉ ở 0.3 mml-NOARG.

Trong các đoạn mạch bị co thắt bởi K⁺ (60 mm), acetylcholine gây ra sự thư giãn phụ thuộc vào nồng độ. Khi các mạch được ủ với 0.3 mml-NOARG và sau đó bị co thắt bằng K⁺ (60 mm), tất cả các phản ứng thư giãn đối với acetylcholine đều bị xóa bỏ.

Sự hiện diện của enzyme tổng hợp NO trong các sợi thần kinh và các bằng chứng dược lý cho sự thư giãn thông qua NO đối với ba đào và niệu đạo cho thấy NO hoặc một chất liên quan đến NO có thể đóng vai trò trong truyền dẫn thần kinh ức chế ở các vùng này. Trong bàng quang, sự hiện diện của enzyme tổng hợp NO trong dây thần kinh có thể được chứng minh, nhưng tầm quan trọng chức năng của nó vẫn chưa rõ ràng. NO, cũng như các yếu tố khác có nguồn gốc từ nội mô, dường như có liên quan đến sự thư giãn do acetylcholine dẫn dắt, phụ thuộc vào nội mô ở các động mạch bàng quang của lợn.

Các thí nghiệm gắn kết bão hòa với [¹²⁵I]‐PD151242 cho thấy sự gắn kết có độ ái lực cao với một nhóm thụ thể ET_A trong đồng nhất tiểu não (pK_d = 9.95 ± 0.14; B_max = 30 ± 15 fmol mg⁻¹ protein).

Các thí nghiệm cạnh tranh đã được thực hiện với các ligand không chọn lọc hoặc chọn lọc cho các loại thụ thể endothelin. Thụ thể endothelin chuột trong tiểu não có độ ái lực cao đối với endothelin‐1 (ET‐1), endothelin‐3 (ET‐3) và sarafotoxin‐S6c (STX‐6c), mặc dù độ ái lực đối với ET‐3 cao hơn một chút so với ET‐1 khi sử dụng cả hai radioligand. Các chất đối kháng chọn lọc ET_A, BQ123, BMS‐182,874 và JKC‐301 đều có độ ái lực thấp tại các thụ thể endothelin. Ngược lại, các chất kích thích chọn lọc ET_B, IRL1620 và [Ala^1,3,11,15]ET‐1 và đối kháng chọn lọc ET_B, BQ‐788 có độ ái lực trung bình tại thụ thể endothelin, trong khoảng nanomolar thấp. Chất kích thích ET_B, BQ3020, có độ ái lực cao gấp khoảng 10 lần so với IRL1620 và [Ala^1,3,11,15]ET‐1 tại thụ thể endothelin chuột tiểu não. Các chất đối kháng không chọn lọc, Ro‐46,2005, Ro‐47,0203 và PD‐142,893 có độ ái lực trung bình tại thụ thể tiểu não.

Bởi vì [¹²⁵I]‐BQ3020 chỉ nhận diện một phần nhỏ trong số các vùng gắn kết của [¹²⁵I]‐ET‐1, hầu hết các thụ thể endothelin trong tiểu não không thể được xếp loại là ET_B. Mặc dù [¹²⁵I]‐PD151242 đã có thể phát hiện các thụ thể ET_A trong các đồng nhất tiểu não chuột, nhóm nhỏ các thụ thể ET_A (chiếm 2% tổng số thụ thể endothelin như đo được bằng [¹²⁵I]‐ET‐1) không thể giải thích cho nhóm thụ thể không phải ET_B. Chúng tôi kết luận rằng thụ thể tiểu não chuột có đặc điểm tương tự như thụ thể ET_B1 vì nó có độ ái lực cao đối với ET‐1, ET‐3, STX‐6c và nhạy cảm vừa phải với PD‐142,893. Tuy nhiên, vì các ligand ET_B BQ‐788, IRL1620 và [Ala^1,3,11,15]ET‐1 chỉ có độ ái lực trung bình đối với thụ thể endothelin tiểu não chuột và do ET‐3 có độ ái lực cao hơn so với ET‐1, kết quả của chúng tôi gợi ý rằng tiểu não chuột chủ yếu chứa các thụ thể ET_C.

Ảnh hưởng của một số hợp chất có khả năng ức chế mạnh mẽ nitric oxide synthase in vitro được khảo sát về độc tính thần kinh do L‐CPA gây ra 48 giờ sau khi dùng L‐CPA, để khám phá xem liệu sự chết của tế bào thần kinh có phải là một phần do sự tạo ra nitric oxide quá mức hay không. Bốn chất ức chế đã được nghiên cứu: N^G‐nitro‐L‐arginine (L‐NOARG), N^G‐nitro‐L‐arginine methyl ester (L‐NAME), N^G‐iminoethyl‐L‐ornithine (L‐NIO) và 3‐bromo‐7‐nitroindazole (BrNI).

Việc sử dụng L‐NAME (50 mg kg⁻¹, tiêm trong phúc mạc hai lần mỗi ngày) và BrIN (50 mg kg⁻¹, tiêm trong phúc mạc hai lần mỗi ngày) đã ngăn ngừa sự mất mát tế bào hạt do L‐CPA gây ra, có thể đạt tới 80–90% tổng số tế bào trong các con chuột được điều trị bằng L‐CPA đơn độc. L‐NOARG (50 mg kg⁻¹, tiêm trong phúc mạc hai lần mỗi ngày) và L‐NIO dùng với liều 25 hoặc 100 mg kg⁻¹, hai lần mỗi ngày không tạo ra bất kỳ sự bảo vệ đáng kể nào chống lại độc tính thần kinh do L‐CPA gây ra.

Cả L‐NAME và BrIN cũng đã ngăn ngừa sự tăng nước và nồng độ natri trong tiểu não do L‐CPA gây ra. L‐NIO khi được dùng với liều cao nhất đã ngăn chặn sự tăng nồng độ natri trong tiểu não nhưng không ngăn chặn nồng độ nước. L‐NIO và L‐NOARG không hiệu quả trong việc ngăn chặn sự tăng nồng độ nước và natri trong tiểu não do L‐CPA gây ra.

Sự giảm nồng độ aspartate và glutamate trong tiểu não và tăng nồng độ glutamine và GABA do L‐CPA gây ra đã được ngăn chặn bởi L‐NAME và BrIN, nhưng không phải bởi L‐NIO hay L‐NOARG. Ngoài ra, sự giảm trong việc gắn kết L‐[³H]‐glutamate với các thụ thể ionotropic và metabotropic glutamate trong lớp tế bào hạt của tiểu não chuột cũng đã bị ngăn cản bởi L‐NAME và BrIN, nhưng không phải bởi L‐NIO hay L‐NOARG.

Tóm lại, sự bảo vệ thần kinh mà L‐NAME và BrIN mang lại cho thấy rằng sự hoại tử tế bào hạt tiểu não do L‐CPA có thể được điều hòa hoặc liên quan đến sự tạo ra nitric oxide quá mức. Việc các chất ức chế nitric oxide synthase, L‐NOARG và L‐NIO không thể cung cấp sự bảo vệ có thể là do khả năng thâm nhập hạn chế vào não (L‐NIO) hoặc sự phân tách nhanh khỏi enzyme.

Các thí nghiệm đã được thực hiện để xác định xem nitric oxide synthase cấu trúc (NOS) hay dạng NOS cảm ứng (iNOS) chịu trách nhiệm cho cái chết tế bào thần kinh. Sự kích hoạt của NOS đã được xác nhận bởi sự tăng 39% trong nồng độ nitrate và nitrite tổng thể của tiểu não trong các não đã được điều trị L-CPA, so với nhóm đối chứng (đối chứng = 2.53 ± 0.10; điều trị L-CPA = 3.51 ± 0.31 nmol mg⁻¹ protein, P < 0.01 từ kiểm định Student's t, n = 6, trung bình ± s.e.mean). Các phép đo sinh hóa của tổng hoạt tính NOS đã được thực hiện trong các mẫu đồng thể của tiểu não 6 giờ và 48 giờ sau khi cho L-CPA, thời gian mà nồng độ L-CPA đạt cực đại trong não và thời điểm có tỷ lệ cao của cái chết tế bào hạt tiểu não, tương ứng. Hoạt tính NOS được đo bằng lượng [³H]-arginine chuyển thành [³H]-citrulline, không cho thấy sự khác biệt nào giữa nhóm đối chứng (chuột được cho nước) và động vật được cho L-CPA ở cả 6 giờ và 48 giờ sau khi cho. Hơn nữa, khả năng của ba chất ức chế NOS, N^G-nitro-L-arginine, 7-bromo-3-nitroindazole và S-methylisothiourea để ngăn chặn sự chuyển đổi của [³H]-citrulline thành [³H]-arginine là giống nhau ở các thời điểm 6 và 48 giờ trong chuột đối chứng và chuột được điều trị L-CPA.

Autoradiography định lượng sử dụng [³H]-N^G-nitro-L-arginine đã được sử dụng để đo lường phân bố giải phẫu tương đối và số lượng enzyme NOS trong tiểu não của các nhóm đối chứng và chuột được điều trị L-CPA sau 48 giờ. Không có sự thay đổi đáng kể nào trong việc gắn kết của [³H]-N^G-nitro-L-arginine tới các lớp hạt và lớp phân tử của tiểu não trong não của chuột đối chứng và chuột được điều trị L-CPA.

Western blotting sử dụng kháng thể chống enzyme NOS cảm ứng đã không phát hiện được protein trong các mẫu tiểu não của chuột được điều trị L-CPA khi đo lường 48 giờ sau khi cho L-CPA.

Tóm lại, sự gia tăng nồng độ nitrate/nitrite trong tiểu não của các chuột được điều trị L-CPA cung cấp thêm bằng chứng cho việc kích hoạt NOS trong tiểu não sau khi cho L-CPA. Việc không chứng minh được sự gia tăng hoạt tính NOS ở 6 hoặc 48 giờ trong chuột được điều trị L-CPA so với các đối chứng cho thấy rằng nguồn gốc nitric oxide chịu trách nhiệm cho cái chết tế bào hạt phải xuất phát từ enzyme NOS cấu trúc, có thể là dạng thần kinh mà rất giàu trong tiểu não. Giả thuyết này đã được củng cố thêm bằng Western blotting và autoradiography định lượng.