American Journal of Physiology - Renal Physiology

We have utilized [3H] gelatin to document high activity of a metalloproteinase present in freshly isolated rat glomeruli. [3H] gelatin degradation by glomeruli was markedly inhibited by EDTA (10 mM: -89 +/- 2.3%) and o-phenanthroline (2 mM: -72 +/- 0.1%), inhibitors of metalloproteinases. No significant inhibition of [3H]gelatin degradation was observed with inhibitors of serine or cysteine proteinases. Most (greater than 80%) of the glomerular metalloproteinase (GLOMP) activity was associated with the pellet after centrifugation of sonicated glomeruli at 100,000 g for 90 min. The pH optimum for gelatin degradation by sonicated glomeruli was approximately pH 8.5. Sodium dodecyl sulfate substrate (gelatin)-polyacrylamide gel electrophoresis revealed a single major band of EDTA-inhibitable gelatin-degrading activity with a molecular mass of approximately 116-125 kDa. The GLOMP activity was not inhibited by tissue inhibitors of metalloproteinases, did not appear to be latent, and was not activated by organomercurial activators of several latent metalloproteinases. GLOMP activity was increased 3.4-fold after incubation with trypsin (20 micrograms/ml, 25 min, 22 degrees C). These data indicate that GLOMP is distinct from the previously described matrix metalloproteinases, as well as other metalloproteinases present in the kidney, including the gelatinase secreted by cultured mesangial cells, Meprin, and endopeptidase 24.11 (enkephalinase, EC 3.4.24.11).

Cơ chế vận chuyển Ca2+ bởi các đoạn khác nhau của ống thận xa đã được nghiên cứu in vitro bằng kỹ thuật ống dẫn máu cách ly. Sự hấp thu canxi trong ống thận xoắn xa (DCT) và phần hạt của ống thu thập vỏ (CCTg) đã được tăng cường một cách đáng kể trong sự hiện diện của hormone tuyến cận giáp (PTH), 3 X 10(-2) U/ml. Na+ được hấp thu từ và K+ được bài tiết vào lòng DCT. Sự hiện diện của amiloride (5 X 10(-5) M) hoặc furosemide (5 X 10(-5) M) trong dung dịch perfusate của DCT đã làm giảm một phần sự hấp thu Na+ nhưng không ảnh hưởng đến sự hấp thu Ca2+. Kết quả trên với Na+ phù hợp với tính chất không đồng nhất của DCT. Sự hấp thu Na+ ròng và bài tiết K+ cũng xảy ra trong CCTg; cả hai quá trình này đều bị ức chế hoàn toàn bởi amiloride. Sự hấp thu Ca2+ diễn ra trong nhánh mỏng hướng lên của vòng Henle; quá trình này không được tăng cường bởi PTH và kết quả phù hợp với sự vận chuyển thụ động. Không có sự dịch chuyển Ca2+ ròng nào được quan sát thấy trong đoạn không hạt (nhẹ) của ống thu thập vỏ, bất kể có mặt hay không có PTH hoặc dibutyryl cyclic adenosine monophosphate.

Heme oxygenase-1 (HO-1), một gen bảo vệ tế bào, thường được kích thích trong các ống thận ở thận bị bệnh. Do proteinuria là dấu hiệu đặc trưng của bệnh thận, chúng tôi đã xem xét mối quan hệ giữa proteinuria và việc kích thích HO-1 trong ống thận, cụ thể là đặt câu hỏi liệu việc gia tăng lưu thông protein qua biểu mô ống thận, do kết quả của proteinuria, có kích thích biểu hiện HO-1 trong ống thận hay không. Chúng tôi đã nghiên cứu một mô hình proteinuria cầu thận do tiêm BSA hàng ngày, mô hình này có liên quan đến việc tăng cường hấp thụ protein từ ống thận và một mô hình proteinuria ống thận do maleate, mô hình sau cho thấy giảm hấp thụ và lưu thông protein ở ống thận. Mô hình proteinuria cầu thận với BSA không cho thấy sự kích thích của HO-1; HO-1 không được kích thích trong các tế bào biểu mô ống thận gần gũi tiếp xúc với BSA. Ngược lại, trong bệnh thận maleate mà trong đó việc hấp thụ protein ở ống thận bị giảm do tổn thương ống thận gần gũi toàn diện do maleate gây ra, HO-1 đã được kích thích mạnh mẽ ở ống thận gần gũi; việc ức chế hoạt động của HO trong bệnh thận maleate làm tình trạng proteinuria trở nên xấu đi, tổn thương mô thận, và apoptosis cũng tăng lên. Trong các tế bào biểu mô ống thận gần gũi, maleate kích thích HO-1 và gây ra apoptosis, trong đó tăng cường hơn khi hoạt động của HO bị ức chế. Từ những nghiên cứu này, chúng tôi kết luận rằng biểu hiện của HO-1 trong thận bị bệnh không thể được quy cho hấp thụ và chuyển hóa protein như albumin trong ống thận, và rằng biểu hiện của HO-1 trong mô hình proteinuria ống thận phản ánh một phản ứng căng thẳng có ý nghĩa chức năng đối với tổn thương ống thận do độc tố gây ra.

Carbon monoxide (CO), một sản phẩm của quá trình chuyển hóa heme do các enzyme heme oxygenases, được biết đến với khả năng bảo vệ chống lại stress oxy hóa. Chúng tôi giả thuyết rằng CO sẽ bảo vệ tổn thương thiếu máu - tái tưới máu (I/R) của các cơ quan được ghép, và hiệu quả của CO đã được nghiên cứu trong mô hình ghép thận chuột cống. Một mảnh thận chuột cống Lewis, được bảo quản trong dung dịch University of Wisconsin ở 4°C trong 24 giờ, đã được ghép vào vị trí tự nhiên trong các chuột đồng huyết. Những con chuột nhận ghép được duy trì trong không khí phòng hoặc tiếp xúc với CO (250 ppm) trong không khí trong 1 giờ trước và 24 giờ sau khi ghép. Động vật đã bị giết 1, 3, 6, và 24 giờ sau khi ghép để đánh giá hiệu quả của CO hít vào. Sự gia tăng nhanh chóng của mRNA cho IL-6, IL-1β, TNF-α, ICAM-1, heme oxygenase-1, và synthase nitric oxide cảm ứng đã được quan sát thấy trong vòng 3 giờ sau khi ghép ở các mảnh ghép kiểm soát của những con chuột được tiếp xúc với không khí, liên quan đến các bằng chứng mô học của hoại tử ống cấp tính, chảy máu mô kẽ, và phù nề. Ngược lại, sự gia tăng của các chất trung gian viêm đã bị ức chế rõ rệt ở các mảnh ghép thận của những con chuột được điều trị bằng CO, điều này tương quan với việc cải thiện lưu lượng máu vỏ thận. Các phân tích hình thái học chi tiết hơn cho thấy rằng CO duy trì cấu trúc mạch máu cầu thận và sự sống sót của tế bào podocyte với ít sự apoptosis của các tế bào biểu mô ống thận và ít sự xâm nhập của tế bào đại thực bào ED1⁺. Việc hít CO đã dẫn đến cải thiện mức creatinine huyết thanh và độ thanh thải, và sự sống sót của động vật đã được cải thiện đáng kể với CO từ 25 ngày lên 60,5 ngày ở các trường hợp đối chứng không điều trị. Nghiên cứu chứng minh rằng việc tiếp xúc với CO ở nồng độ thấp ở những người nhận ghép thận có thể mang lại hiệu ứng bảo vệ đáng kể chống lại tổn thương I/R thận và cải thiện chức năng của các mảnh ghép thận.

Chúng tôi đã nghiên cứu tác động của chất ức chế heme oxygenase (HO) là stannous mesoporphyrin (SnMP; 40 μmol/kg iv) đối với huyết động học thận ở chuột gây mê với và không có điều trị trước 48 giờ bằng N ^G-nitro-l-arginine methyl ester (l-NAME), một chất ức chế tổng hợp nitric oxide (NO). SnMP làm giảm lưu lượng máu thận (RBF) và tăng kháng lực mạch máu thận (RVR) ở cả hai nhóm. Sự giảm RBF do SnMP gây ra ở chuột đã được điều trị bằng l-NAME rõ rệt hơn so với chuột không điều trị trước (43 ± 7 so với 13 ± 3%) như cũng tương tự đối với sự gia tăng RVR do SnMP gây ra (87 ± 31 so với 14 ± 5%). Hiệu ứng co mạch thận của SnMP liên quan phần nào đến việc khuếch đại các cơ chế co mạch thần kinh-hormone hiện có, bởi vì ở chuột đã được điều trị bằng l-NAME, hiệu ứng này bị ngăn chặn bởi việc sử dụng đồng thời prazosin hoặc losartan. Tuy nhiên, SnMP (15 μmol/l) cũng gây ra co mạch trong các động mạch liên thận tách rời, có áp lực, và phản ứng này mạnh mẽ hơn trong các mạch được lấy từ chuột đã được điều trị bằng l-NAME so với chuột không có điều trị trước. Những dữ liệu này chỉ ra rằng trạng thái tổng hợp NO ảnh hưởng đến phản ứng mạch máu đối với việc ức chế HO trong thận chuột.

Chúng tôi đã chứng minh trước đây rằng monoxit cacbon (CO) kích thích kênh K⁺ 70-pS trên bề mặt apical của nhánh dày (TAL) trong thận chuột (Liu HJ, Mount DB, Nasjletti A, và Wang WH. J Clin Invest 103: 963-970, 1999). Bởi vì kênh K⁺ ở bề mặt apical đóng vai trò quan trọng trong việc tái hấp thu K⁺, chúng tôi đã thử nghiệm giả thuyết rằng các chuyển hóa phẩm phụ của heme phụ thuộc vào heme oxygenase (HO) có thể ảnh hưởng đến sự vận chuyển Na⁺ trong TAL. Chúng tôi đã sử dụng vi phẫu in vivo để nghiên cứu ảnh hưởng của chromium mesoporphyrin (CrMP), một tác nhân ức chế HO, đến sự hấp thu dịch (J_v) và hấp thu Na⁺ (J_Na) trong ống Henle và các phương pháp thanh thải thận để xem xét tác động của CrMP đến sự bài tiết natri trong thận. Các thí nghiệm vi phẫu đã chứng minh rằng việc thêm CrMP vào ống Henle làm giảm J_v 13% và J_Na 20% ở động vật ăn thức ăn bình thường, và gây ra sự giảm J_v (39%) và J_Na (40%) ở chuột ăn chế độ ăn giàu K⁺ (HK). Tác động của CrMP là kết quả của sự ức chế HO vì việc thêm MgPP, một đồng phân của CrMP mà không ức chế HO, không có tác động đến J_v. Phân tích Western blot cho thấy HO-2 được biểu hiện trong thận và mức độ của HO-2 đã tăng đáng kể ở động vật ăn chế độ ăn HK. Các nghiên cứu thanh thải thận chứng minh rằng việc truyền CrMP làm tăng bài tiết Na⁺ trong nước tiểu (E_Na) và thể tích (UV) mà không có sự thay đổi trong tỷ lệ lọc cầu thận. Tác động của CrMP lên E_Na và UV lớn hơn ở chuột HK so với những con ăn chế độ ăn bình thường. Chúng tôi kết luận rằng việc tiêu thụ HK làm tăng sự biểu hiện của HO-2 trong thận và các chuyển hóa phẩm phụ của heme phụ thuộc vào HO, có thể là CO, đóng vai trò quan trọng trong việc điều hòa vận chuyển Na⁺ trong ống Henle.

Heme oxygenase 1 (HO-1) được kích thích trong phản ứng với căng thẳng tế bào và có trách nhiệm chuyển đổi phân tử heme prooxidant thành các lượng tương đương biliverdin (BV), carbon monoxide (CO) và sắt. BV sau đó được chuyển đổi thành bilirubin (BR) bởi enzyme biliverdin reductase. Bằng chứng thực nghiệm cho thấy việc kích thích hệ thống HO là một cơ chế nội sinh quan trọng cho bảo vệ tế bào và rằng các sản phẩm downstream của sự phân hủy heme, CO, BR và BV, có thể trung gian cho các tác động tích cực mạnh mẽ này. Những phân tử này, vốn trước đây được coi là sản phẩm thải độc hại, gần đây đã được chứng minh có các tính chất giãn mạch, chống oxy hóa và chống viêm phụ thuộc vào liều, điều này đặc biệt mong muốn cho việc bảo vệ mô trong quá trình cấy ghép nội tạng. Thực tế, công trình gần đây đã chứng minh rằng việc sử dụng CO, BR hoặc BV ngoại sinh có thể cung cấp một phương pháp đơn giản và ít tốn kém để thay thế cho các tác động bảo vệ tế bào của HO-1 trong nhiều mô hình lâm sàng khác nhau. Bài tổng quan này sẽ cố gắng tóm tắt các đặc tính sinh hóa và bảo vệ tế bào liên quan của CO, BR và BV, và sẽ thảo luận về các nghiên cứu mới nổi liên quan đến các ứng dụng điều trị của những phân tử này trong thận và các hệ thống nội tạng khác.

Được công bố lần đầu vào ngày 9 tháng 8 năm 2001; 10.1152/ajprenal.00140.2001.—Heme oxygenase-1 (HO-1) xúc tác bước hạn chế tốc độ trong quá trình phân giải heme, giải phóng sắt, carbon monoxide và biliverdin. Sự kích thích HO-1 xảy ra như một phản ứng thích nghi và bảo vệ đối với một số tác nhân gây viêm. Yếu tố phiên mã protein hoạt hóa-1 (AP-1) đã được cho là có liên quan đến việc kích hoạt gen HO-1. Để làm sáng tỏ cơ chế phân tử của việc kích thích HO-1, chúng tôi đã kiểm tra tác động của diferuloylmethane (curcumin), một chất ức chế yếu tố phiên mã AP-1. Thật bất ngờ, curcumin tự nó lại là một tác nhân kích thích HO-1 rất mạnh. Curcumin có tác dụng chống viêm, chống oxy hóa và bảo vệ thận. Để đánh giá cơ chế kích thích HO-1 do curcumin điều hòa, các tế bào ống thận gần của người đã được tiếp xúc với curcumin (1–8 μM). Chúng tôi đã quan sát thấy sự kích thích mRNA HO-1 theo thời gian và liều lượng tương ứng với sự gia tăng protein HO-1. Sự đồng ấp giữa curcumin với actinomycin D hoàn toàn chặn lại sự tăng cường mRNA HO-1. Việc chặn yếu tố hạt nhân-κB (NF-κB) bằng chất ức chế phosphoryl hóa IκBα đã làm giảm sự kích thích mRNA và protein HO-1 do curcumin gây ra. Những dữ liệu này cho thấy curcumin kích thích mRNA và protein HO-1 trong các tế bào ống thận gần. Việc kích thích HO-1 do curcumin là do cơ chế phiên mã và liên quan đến con đường NF-κB.

Các bằng chứng mới nổi đã chỉ ra rằng tổn thương tế bào podocyte và sự giảm biểu hiện các protein đặc hiệu của podocyte góp phần vào tình trạng protein niệu trong tiền sản giật. Chúng tôi đã thu thập mẫu nước tiểu từ phụ nữ mắc tiền sản giật để nghiên cứu xem việc thoát protein đặc hiệu của podocyte có liên quan đến sự rối loạn chức năng của hàng rào thận hay không. Các mẫu nước tiểu từ phụ nữ mang thai bình thường và từ những phụ nữ mang thai có mắc tăng huyết áp mãn tính được sử dụng để so sánh. Chúng tôi xác định nồng độ protein khe podocyte hòa tan nephrin trong các mẫu nước tiểu. Các nồng độ podocalyxin, βig-h3 và VEGF cũng được đo. Chúng tôi nhận thấy rằng nephrin và podocalyxin hầu như không thể phát hiện trong các mẫu nước tiểu từ phụ nữ mang thai bình thường và từ những phụ nữ mắc tăng huyết áp mãn tính. Trong tiền sản giật, nồng độ nephrin và podocalyxin trong nước tiểu tăng đáng kể và có sự tương quan cao với nhau, r²= 0.595. Nephrin và podocalyxin cũng có sự tương quan với nồng độ protein trong nước tiểu. βig-h3 đã được phát hiện trong các mẫu nước tiểu từ phụ nữ mắc tiền sản giật và có sự tương quan cao với nồng độ nephrin và podocalyxin ở tiền sản giật. βig-h3 không thể phát hiện trong thai kỳ bình thường và thai kỳ mắc tăng huyết áp mãn tính. Nồng độ VEGF cũng tăng cao ở phụ nữ mắc tiền sản giật so với những người mang thai bình thường và mang thai có mắc tăng huyết áp mãn tính. Những kết quả này cung cấp bằng chứng mạnh mẽ rằng việc thoát protein podocyte xảy ra trong tiền sản giật, và các mức độ của chúng liên quan đến protein niệu. Việc phát hiện sự bài tiết βig-h3 trong nước tiểu ở bệnh nhân tiền sản giật cho thấy rằng hoạt tính của yếu tố tăng trưởng chuyển đổi có thể cũng liên quan đến tổn thương thận trong rối loạn thai kỳ này.

Yếu tố tăng trưởng nội mô mạch máu (VEGF) có tác dụng chống độc tế bào ở tế bào podocyte. Hơn nữa, người ta đã gợi ý rằng nephrin, một phân tử liên kết tế bào của màng khe podocyte, có thể góp phần vào cơ chế chống chết theo chương trình ở các tế bào này. Do đó, chúng tôi đã nghiên cứu xem liệu VEGF có tín hiệu để giảm apoptosis và vai trò của nephrin trong cơ chế sống còn này hay không. Phân tích tế bào dòng cho thấy rằng các tế bào podocyte có đột biến nephrin có tỷ lệ apoptosis cao hơn đáng kể. Mặc dù VEGF đã giảm apoptosis trong tế bào podocyte người được duy trì điều kiện vô tận [loại hoang dã (WT)] đến 18.1% so với kiểm soát (P < 0.001), nhưng nó không thể thực hiện điều này ở các tế bào podocyte người bị thiếu nephrin. Hơn nữa, phương pháp Western blot và phát hiện miễn dịch với kháng thể chống nephrin cho thấy sự phosphoryl hóa của nephrin, so với các tế bào WT bị đói huyết tương, đã tăng đáng kể (tỉ lệ 3.36 ± 1.2 so với kiểm soát, P < 0.05) sau điều trị bằng VEGF và giảm đáng kể khi điều trị bằng kháng thể đơn dòng trung hòa VEGF (mAb) (tỉ lệ 0.2 ± 0.09 so với kiểm soát, P < 0.05). Đường tín hiệu AKT đã được cho là liên quan đến sự ức chế apoptosis do nephrin trung gian ở các tế bào đã chuyển gen, nhưng vai trò của đường này chưa bao giờ được chứng minh rõ ràng ở các tế bào podocyte. Đáng ngạc nhiên, VEGF ngoại sinh đã giảm phosphoryl hóa AKT/PKB trong các tế bào podocyte bình thường nhưng lại làm tăng phosphoryl hóa này trong các tế bào podocyte thiếu nephrin. Do đó, chúng tôi giả định rằng VEGF ngoại sinh và nội sinh (xuất phát từ podocyte) đều có thể kích thích phosphoryl hóa nephrin và qua hành động này có thể ngăn chặn apoptosis của tế bào podocyte. Tuy nhiên, sự tham gia của AKT trong phản ứng sống còn này ở các tế bào podocyte người bình thường vẫn chưa rõ ràng.