Gen gen protein bọc của virus closterovirus-3 liên kết với bệnh cuộn lá nho: nhân bản, giải trình tự nucleotide và biểu hiện trong cây biến đổi gen

Một thư viện cDNA lambda ZAP II đã được tạo ra bằng cách nhân bản cDNA được chuẩn bị từ RNA hai chuỗi có trọng lượng phân tử cao (dsRNA, khoảng 18 kb) phân lập từ các mô bị nhiễm virus closterovirus-3 liên kết với bệnh cuộn lá nho (GLRaV-3). Thư viện cDNA này đã được sàng lọc miễn dịch bằng kháng thể đa dòng và đơn dòng đặc hiệu với protein bọc GLRaV-3, và ba dòng clone dương tính với miễn dịch đã được xác định. Phân tích chuỗi nucleotide từ các dòng clone này cho thấy có một khung đọc mở (ORF) bị cắt ngắn ở đầu 3′; phần còn lại của ORF này đã được thu thập thông qua việc giải trình tự một clone thứ tư chồng chéo với một trong các clone dương tính với miễn dịch. Tổng cộng đã giải trình tự 2028 bp. ORF protein bọc GLRaV-3 dự đoán, dài 939 bp, mã hóa một protein (được gọi là p35) với khối lượng phân tử tính toán M r là 34 866. Phân tích căn chỉnh nhiều chuỗi amino acid của p35 với các chuỗi protein bọc từ các virus closterovirus khác cho thấy rằng các amino acid (R và D) đồng thuận của virus thực vật dạng sợi được bảo tồn ở các vị trí mong đợi. Gen protein bọc GLRaV-3 sau đó đã được thiết kế để biểu hiện cảm và nghịch cảm trong cây biến đổi gen. Cây Nicotiana benthamiana biến đổi gen có chứa gen protein bọc GLRaV-3 cảm đã sản xuất một protein 35 kDa có phản ứng với kháng thể GLRaV-3 trong phương pháp Western blot.